乳腺炎沖劑質量標準研究

段松冷 劉敏 劉禮斌

[摘要] 目的 建立乳腺炎沖劑質量標準。 方法 高效液相色譜（HPLC）法測定乳腺炎沖劑中芍藥苷含量。采用Agilent EClipse SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（40∶60）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL;薄層色譜鑒別乳腺炎沖劑中香附、當歸和赤芍;重金屬檢查法和砷鹽檢查法測定乳腺炎沖劑中重金屬和砷鹽限度。 結果 HPLC法測定芍藥苷含量：芍藥苷質量濃度在5.01～501 μg/mL（r = 0.9996）范圍內與峰面積呈良好的線性關系，平均回收率為99.92%，RSD = 1.26%（n = 6）;薄層色譜法：樣品斑點清晰，無陰性干擾;乳腺炎沖劑重金屬和砷鹽限度檢查，結果符合規定。 結論 HPLC法測定結果準確、靈敏度高、重復性好;薄層色譜法操作簡便，試驗周期短，結果清晰可靠;現行藥典中重金屬和砷鹽檢查法可以用于乳腺炎沖劑重金屬和砷鹽的的限度檢查，以上方法為建立乳腺炎沖劑治療標準提供了依據。

[關鍵詞] 乳腺炎沖劑;質量標準;高效液相色譜法;薄層色譜;重金屬砷鹽限度檢查

[中圖分類號] R282 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）12（c）-0111-04

[Abstract] Objective To establish the quality standard of Mastitis Granules. Methods Paeoniflorin content in Mastitis Granules was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. Agilent EClipse SB-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used as the column， methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （40∶60） was used as the mobile phase， the volume flow rate of 1.0 mL/min， with the detection wavelength of 230 nm. The colomn temperature maintained at 30℃. The injection volume was 10 μL. The identification of Cyperus rotundus L.， Angelica sinensis and Paeoniae Radix Rubra in Mastitis Granules were determined by thin-layer chromatography （TLC）. The limits of heavy metals and arsenic salts in Mastitis Granules were determined by heavy metal test method and arsenate test separately. Results The content of paeoniflorin was determined by HPLC. The paeoniflorin in the range of 5.01-501 μg/mL（r = 0.9996） showed a good linear relationship with the peak area. The average recovery rate was 99.92%， RSD = 1.26% （n = 6）. The spots of TLC samples were clear and there was no negative interference， the limit tests of heavy metals and arsenic salts in Mastitis Granules were in accordance with the regulations. Conclusion The results of determination by HPLC are accurate， sensitive and reproducible. TLC method is simple and easy to operate， with short test period and clear and reliable results. The current pharmacopoeia method for heavy metals and arsenic salts can be used for the limit examination of heavy metals and arsenic salts in Mastitis Granules. The above methods provide a basis for establishing the treatment standard of Mastitis Granules.

[Key words] Mastitis Granules; Quality standard; High performance liquid chromatography; Thin-layer chromatography; Limit examination of heavy metal arsenic salt

乳腺炎沖劑是北京市醫療機構的法定中藥制劑，北京市多家醫療機構具有該制劑的批準文號，用于治療乳腺炎等疾病。本制劑收載于《醫療單位制劑規程》[1]，是由柴胡、桔葉、炙香附、川楝子、瓜蔞、敗醬草、絲瓜絡、當歸、赤芍、陳皮組成的復方制劑。《醫療單位制劑規程》[1]沒有關于該制劑定性定量的控制項目，亦沒有對乳腺炎沖劑質量標準其他項目提出要求，查閱文獻，尚缺乏對乳腺炎沖劑質量標準研究的相關收載。因此，本研究參考首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院（以下簡稱“我院”）乳腺炎沖劑生產工藝規程，以我院制劑室生產的乳腺炎沖劑為研究對象，以加強乳腺炎沖劑質量控制為目的，建立了乳腺炎沖劑中芍藥苷含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，對柴胡、瓜蔞、香附、川楝子、當歸、赤芍的薄層色譜鑒別進行了研究，建立了香附、當歸和赤芍的薄層色譜鑒別方法，并考察了該制劑重金屬及砷鹽情況。該研究結果為重新修訂《醫療單位制劑規程》提供了的試驗依據。

1 儀器、試劑與試藥

高效液相色譜儀（導津公司 LC-20A），千分之一電子分析天平（梅特勒GB303），甲醇、甲苯等試劑均為分析純。柴胡（批號：120992-201108）、瓜蔞（批號：120836-201211）、香附（批號：121059-200706）、當歸（批號：120927-201315）對照藥材及芍藥苷對照品（批號：110736-201136）均購自中國食品藥品檢定研究院。乳腺炎沖劑樣品（批號：20180622、20180623、2018 0624）為我院制劑室制備。柴胡陰性（批號：20180622）、瓜蔞陰性（批號：20180622）、香附陰性（批號：20180629）、當歸陰性（批號：20180829）及赤芍陰性（批號：0180706）樣品為實驗室制備。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定芍藥苷含量

2.1.1 色譜條件 ?Agilent EClipse SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（40∶60）為流動相，檢測波長230 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。理論板數按芍藥苷峰計算應不低于3000。

2.1.2 溶液的制備 ?取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.501 mg/mL芍藥苷的溶液作為對照品溶液。取研細后的乳腺炎樣品0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱重，浸泡30 min，超聲提取30 min，放冷，補重，濾過作為供試品溶液。照供試品溶液制備方法取赤芍陰性樣品制備赤芍陰性對照溶液。

2.1.3 專屬性考察 ?吸取芍藥苷對照品溶液、供試品溶液、芍藥苷陰性對照溶液各10 μL，結果陰性對照無干擾，與相鄰峰分離度良好。見圖1。

2.1.4 線性關系考察 ?取上述制備的對照品溶液，逐級稀釋成濃度為5.01、10.02、20.04、50.1、100.2、200.4、501 μg/mL的芍藥苷標準品溶液，各吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y = 14 052X-63 298，R2 = 0.9996。

2.1.5 精密度試驗 ?精密吸取芍藥苷對照品溶液（0.501 mg/mL）適量，連續進樣6次，測定對照品的峰面積，平均值為1 059 998，RSD值為0.23（n = 6），提示儀器的精密度良好。

2.1.6 穩定性研究 ?取研細后的乳腺炎細粉0.5 g，精密稱定，依法制備芍藥苷供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、14、24 h進樣進行分析，峰面積平均值為1 060 353，RSD值為0.59（n = 6），提示供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 ?均勻取研細后的乳腺炎細粉0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液6份，記錄峰面積，計算芍藥苷含量，測得供試品中的芍藥苷含量平均值為4.09 mg/g，相對標準偏差RSD = 1.30%，提示方法的重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 ?分別精密稱取9份已知含量的乳腺炎細粉0.25 g于容量瓶中，精密加入低、中、高3個水平的芍藥苷對照品溶液，每個水平制備3份。按“2.1.3”項中的方法進行加樣回收率試驗，按“2.1.1”項中的方法測定芍藥苷含量，計算加樣回收率。見表4。

2.2 薄層色譜研究

2.2.1 香附的薄層色譜鑒別 ?取樣品10 g，加乙醚40 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液[2]。取香附對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取香附陰性樣品10 g，按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中華人民共和國藥典以下簡稱“中國藥典”2015年版附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述3種溶液各4 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（80∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，無陰性干擾。見圖3。

2.2.2 當歸的薄層色譜鑒別 ?取“2.2.1”項下供試品溶液待檢。取當歸對照藥材1 g，按“2.2.1”項下供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取當歸陰性樣品10 g，同法制成陰性樣品溶液。照“2.2.1”中薄層色譜法，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，無陰性干擾。見圖4。

2.2.3 赤芍的薄層色譜鑒別 ?取樣品10 g，加乙醇40 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取芍藥苷對照品適量，加乙醇制成2 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。取赤芍陰性樣品10 g，按“2.2.1”項目供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。照“2.2.1”中薄層色譜法，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，無陰性干擾。見圖5。

2.3 重金屬、砷鹽考察

2.3.1 重金屬 ?取本品3批，每批各1 g，稱定重量，置坩堝中，緩緩加熱至完全碳化，放冷，加硫酸1 mL，低溫加熱至硫酸蒸氣除盡后，加硝酸0.5 mL，蒸干，至氧化氮蒸氣除盡后，在500～600℃熾灼使完全灰化，照《中國藥典》2015版4部[3]重金屬檢查法第二法，對3批樣品進行了測定，結果重金屬檢查（ppm）<10，均符合規定。

2.3.2 砷鹽 ?取本品3批，每批各1 g，稱定重量，置坩堝中，加氫氧化鈣1 g，緩緩加熱至完全碳化，放冷，在500～600℃熾灼使完全灰化，照《中國藥典》2015版4部[3]砷鹽檢查法第一法，對3批樣品進行了測定，結果砷鹽檢查（ppm）<2，均符合規定。砷斑照片。見圖6。

3 討論

本研究最初擬用HPLC法測定乳腺炎沖劑中柴胡皂苷a及皂苷d含量，查閱多篇相關文獻[4-9]，嘗試多種色譜條件，在柴胡皂苷a保留時間處仍有干擾峰，曾嘗試用大孔吸附樹脂對柴胡皂苷a和皂苷d進行分離提純[10]，仍無法消除干擾。分析原因可能是因為乳腺炎沖劑藥味較多，并采取煎煮法提取，大量水溶性成分的溶出使得干擾較多，較難去除。故本研究選擇測定芍藥苷含量對乳腺炎沖劑進行質量控制，得到了滿意的結果。乳腺炎沖劑共含10味中藥，無質量標準，曾對方中柴胡[11-13]、川楝子[14-15]、瓜蔞[16-17]、敗醬草[18-19]、陳皮[20-21]進行薄層色譜鑒別研究，嘗試中國藥典及多篇文獻方法皆不能取得滿意效果，分析原因可能是由于乳腺炎沖劑在煎煮過程中多種藥味發生化學變化，使原有藥味化學成分轉變，導致薄層色譜無法檢識。因此，本研究僅建立了香附、當歸和赤芍薄層色譜法鑒別法。醫院制劑多為中藥復方制劑，成分復雜，中藥制劑有時重金屬與砷鹽的含量很高，危害人體健康，如鉛在人體和動物組織中能夠蓄積，人若每天攝入1 mg鉛，長期則有中毒危險，過量的鉛可引起貧血、神經功能失調及腎損傷[22]，因此對醫院制劑進行重金屬與砷鹽的限量檢查意義重大。

[參考文獻]

[1] ?北京市衛生局.醫療單位制劑制規程[Z].北京：北京市衛生局，1985.

[2] ?國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：158，258.

[3] ?國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].四部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：101-102.

[4] ?孟杰，陳興福，楊文鈺，等.柴胡主根與側根中柴胡皂苷a及皂苷d含量測定[J].藥物分析雜志，2013，33（7）：1218-1212.

[5] ?劉偉，楊艷玲，劉乃強，等.柴胡口服液HPLC指紋圖譜及柴胡皂苷b2的含量測定[J].中國試驗方劑學雜志，2013， 19（8）：134-137.

[6] ?李軍，姜華，張延萍，等.柴胡口服液工藝藥渣中5種柴胡皂苷的含量測定[J].中國藥學雜志，2012，47（16）：1337-1340.

[7] ?馬澤剛，黃春花，鐘輝云.HPLC法對不同產地柴胡根中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量測定[J].湖北農業科學，2017，56（13）：2519-2520.

[8] ?李競，高英，李海龍，等.太行山區柴胡中總皂苷及柴胡皂苷a、d的含量測定[J].中國醫藥導報，2013，10（8）：124-129.

[9] ?陳新梅，王集會.無名異的質量控制.中國試驗方劑學雜志[J]，2013，19（7）：107-109.

[10] ?宋海妹，蘇小鳳，李楠，等，柴胡皂苷的提取與鑒定[J].大連輕工業學院學報，2015（1）：15-18.

[11] ?嚴華，董亞娟，程顯隆，等.南柴胡與常見混偽品的鑒別方法研究[J].中國藥學，2015，50（2）：109-114.

[12] ?戴培慧，馬瑞蓮，高佳麗，等.基于HPLC分析柴胡黃芩配伍的主要化學成分研究[J].世界中醫藥，2017，12（7）：1660-1663.

[13] ?李騰，高展，孫玉俠，等.柴胡及其制劑中皂苷類成分的研究[J].中成藥，2011，33（11）：1840-1843.

[14] ?王志朝，丁志民，張孟佑，等.三子膠囊的制備及質量標準研究[J].中國藥房，2007，18（9）：665-666.

[15] ?杜怡昊，劉建華，李計龍，等.川楝子中香草酸含量測定研究[J].天然產物研究與開發，2011，23（6）：1103-1106.

[15] ?韓毅，于艷，吳振起，等.清肺膏的質量標準研究[J].山西醫科大學學報，2018，49（1）：31-35.

[16] ?陳秀敏，靳鳳云，彭小冰，等.消疬膠囊質量標準研究[J].中藥材，2016，39（5）：1094-1097.

[17] ?陳惠玲，曾榮潔.婦炎消膠囊質量標準的研究[J].中國藥品標準，2014，15（4）：272-275.

[18] ?羅玉鴻，梁飛華，黃好武，等.復方婦炎平膠囊質量標準控制[J].中國醫院藥學，2009，29（1）：73-75.

[19] ?韓冬，程東巖，王隸書.百苑止咳顆粒質量標準的建立[J].中國藥師，2018，21（8）：1471-1473.

[20] ?莫結麗，張靖，宮璐，等.陳皮精準煮散飲片與市售飲片的質量[J].世界中醫藥，2017，12（11）：2786-2790.

[21] ?徐樂，孔亞萍，孫慧珠，等.舒肝丸質量標準中薄層和液相方法完善研究[J].中國藥事，2018，32（4）：516-521.

[22] ?圭源.藥理學[M].北京：中國醫藥出版社，2003：316-336.

（收稿日期：2019-08-21 ?本文編輯：劉永巧）