溴氰菊酯和辛硫磷亞致死劑量對甜菜夜蛾酶活性的影響

張元建 王 真 竹 傲 朱福興

摘要:研究了溴氰菊酯和辛硫磷亞致死劑量處理后,甜菜夜蛾羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性變化規律,結果表明:經辛硫磷亞致死劑量5.20 mg/kg和溴氰菊酯亞致死劑量0.73 mg/kg處理后,甜菜夜蛾體內CarE和GST均被不同程度的抑制,辛硫磷處理后24 h時與對照相比AChE活性下降了24.87%,而溴氰菊酯對AChE活性沒有明顯抑制作用。

關鍵詞:甜菜夜蛾;亞致死劑量;羧酸酯酶;谷胱甘肽S-轉移酶;乙酰膽堿酯酶

中圖分類號:S433.5,Q965.9文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.012

Effect of Sublethal Doses of Deltamethrin and Phoxim on Enzyme Activity of Beet Armyworm

ZHANG Yuan-jian, WANG Zhen, ZHU Ao, ZHU Fu-xing

(College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China)

Abstract:Effect of sublethal doses of deltamethrin and phoxim on activities of carboxylesterase,glutathione s-transferase and acetylcholinesterase of beet armyworm, Spodoptera exigua (Hübner) were measured. There was a significant decline in CarE and GST activities 24 to 72 hours after treated with sublethal concentration of phoxim and deltamethrin. As for AChE, the activity decreased by 24.87% when compared with the check 24 hours after treated with sublethal concentration of phoxim, while sublethal concentration of deltamethrin had no significant inhibition on AChE activity.

Key words: Spodoptera exigua (Hübner); sublethal concentration; carboxylesterase; glutathione s-transferase; acetylcholinesterase

甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner),屬鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬(曾歸貪夜蛾Laphygma),其別名貪夜蛾,是一種世界性雜食性害蟲,極易產生抗藥性,防治難度較大[1]。殺蟲劑亞致死劑量處理昆蟲后,除了對昆蟲的抗性、行為以及生長發育等產生影響外,還會對昆蟲體內的重要靶標酶如乙酰膽堿酯酶(AChE)、羧酸酯酶(CarE)以及谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等產生一定的影響[2]。本試驗通過研究溴氰菊酯和辛硫磷劑亞致死劑量對甜菜夜蛾體內羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響,為深入研究甜菜夜蛾的抗性以及科學合理用藥提供理論依據。

1材料和方法

1.1供試昆蟲

供試甜菜夜蛾采自湖北,在實驗室內人工飼養多代。在光周期L14:D10,溫度(27±1)℃,濕度70%的條件下飼養,幼蟲用人工飼料飼養[3],所用容器為24孔盤和120孔盤,成蟲羽化后放置于罩有白色紗布的交配器中用5%的白糖水飼喂,白色紗布供成蟲產卵。

1.2供試藥劑及試劑

40%辛硫磷乳油(滄州中天化工有限責任公司生產);2.5%溴氰菊酯乳油(拜耳作物科學中國有限公司生產);碘化硫代乙酰膽堿(ATCh),5, 5-二硫-雙-2-硝基苯甲酸(DTNB),毒扁豆堿(Eserine),考馬斯亮藍G-250(Coomassie Brilliant G-250),Fluka公司生產;1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB),α-乙酸萘酯(α-Naphthyl Acetate),固藍B鹽(Fast blue B Salt),醫藥集團上海化學試劑公司生產;α-萘酚(1-Naphthol),上海化學試劑采購供應五聯化工廠生產;十二烷基硫酸鈉(SDS),天津市凱通化學試劑有限公司生產;還原型谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH),武漢亞法生物技術公司分裝;牛血清白蛋白(BSA),武漢生命技術有限公司生產;其它試劑為國內分析純。

1.3儀器

分光光度計UV-1100,上海美譜達儀器有限公司生產;電子天平SHIMADZU,日本株式會社生產;CRG系列高速冷凍離心機,HITACHI公司生產。

1.4酶活性測定

1.4.1試蟲處理取健康一致的同日齡(3齡)甜菜夜蛾幼蟲,分別用辛硫磷的LC20濃度為5.20 mg/kg和溴氰菊酯的LC20濃度為0.73 mg/kg作為亞致死劑量。測定采用浸葉法,取新鮮甘藍葉片,用清水洗凈并自然涼干后在供試藥劑中浸泡2 min,取出晾干備用,每個處理重復3次,以清水處理為對照,將晾干的葉片放入墊有濕濾紙的養蟲盒中,并接入試蟲,每盒15頭,24 h后檢查蟲體死亡情況并換為人工飼料飼養,分別在0,24,48和72 h時取活蟲制備酶液,其中0 h為接觸藥劑之前的3齡幼蟲。

1.4.2酶源制備分別取經過亞致死劑量處理后不同時間的試蟲(用藥前3齡幼蟲10頭、用藥后24 h 3齡幼蟲8頭,用藥后48 h 4齡幼蟲6頭),放入玻璃勻漿器中,加入0.04 mo1/L,pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)5 mL冰浴勻漿,勻漿液在4℃下,10 000 r/min離心10 min,取上清液作為酶源。

1.4.3羧酸酯酶活性測定取適量稀釋后的酶液1 mL,加入3×10-4 mol/L的α-乙酸萘酯(α-NA)底物1.0 mL和10-4 mol/L毒扁豆堿0.01 mL,混勻后于37 ℃恒溫水浴中反應10 min,然后加入0.5 mL顯色液(1%固藍B鹽溶液∶5%十二烷基硫酸鈉溶液=2∶5,現用現配),搖勻后靜置15 min,于600 nm處比色測定,以磷酸緩沖液取代酶液作為對照[4,5]。以α-萘酚作標準曲線,根據標準曲線方程求得酶促反應生成的α-萘酚量,然后計算出羧酸酯酶的活性。

1.4.4谷胱甘肽S-轉移酶活性測定取2.78 mL 0.01 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液,0.1 mL 0.05 mol/L還原型谷胱甘肽(GSH),1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)丙酮液(0.05 mol/L)0.02 mL ,以及0.1 mL 酶液混合均勻后加入比色杯中,在340 nm處調零,每隔1 min記錄1次吸光度值,共記錄3次[6,7]。取第3分鐘時吸光度變化值,根據GST活力[μmol/(mg·min)]= (△OD×V)/(ε×L) / 酶液蛋白質含量來計算酶活性。其中,△OD為每分鐘吸光度的變化值(OD340/min),V為酶促反應體積(3 mL),ε為產物的消光系數[0.009 6 L/(μmol·cm)][8],L為比色杯的光程(1 cm)。

1.4.5乙酰膽堿酯酶活性測定反應體系總體積0.2 mL ,反應體系組成為:0.1 mL 酶液,0.1 mL 的0.75 mmol/L底物(碘化硫代乙酰膽堿),30℃下反應15 min,加入1.8 mL DTNB-磷酸鹽-乙醇(稱取0.012 4 g DTNB加入120 mL 96%乙醇,80 mL 蒸餾水,用0.1 mol/L pH 7.6磷酸緩沖液定容至250 mL)。在412 nm處比色測定,以磷酸緩沖液取代酶液作為對照[9]。根據乙酰膽堿酯酶活力[nmol/(mg·min)]=(△OD×V)/(ε×L)/酶液蛋白質含量來計算酶活性。其中,△OD為每分鐘吸光度的變化值(OD412/min),V為酶促反應體積(2 mL),ε為產物的消光系數[1.36×104 L/(mol·cm)][10],L為比色杯的光程(1 cm)。

1.4.6 蛋白質含量測定考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[11],以牛血清白蛋白為標準蛋白。

2結果與分析

經辛硫磷亞致死劑量LC20(5.20 mg/kg)和溴氰菊酯亞致死劑量LC20(0.73 mg/kg)處理后,甜菜夜蛾幼蟲的死亡率分別是15.87%和17.46%。

2.1殺蟲劑亞致死劑量對甜菜夜蛾幼蟲羧酸酯酶活性的影響

從圖1可以看出,經辛硫磷亞致死劑量LC20處理后甜菜夜蛾幼蟲羧酸酯酶活性在24 h時明顯降低,與對照相比降低了77.58%,隨后雖然略有回升,但與對照相比仍然較低。經溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后,甜菜夜蛾幼蟲羧酸酯酶活性在48 h內持續下降,24 h時與對照相比降低了35.73%,在72 h時略有上升,但酶活性仍低于對照,經差異顯著性分析,兩種藥劑處理后24~72 h之間羧酸酯酶活性均低于對照,且差異顯著。另外,辛硫磷處理后羧酸酯酶活性下降的幅度大于溴氰菊酯,且差異顯著。

試驗中,隨著時間的變化,對照的3種酶活性都出現了不同程度的下降,尤其是在24~48 h時下降幅度最大,通過試驗中的觀察,48 h時的甜菜夜蛾幼蟲已經從3齡進入4齡階段,這與彭梅等[12]的研究結果——甜菜夜蛾在低齡幼蟲時體內的靶標酶和代謝酶活性高于高齡幼蟲是一致的。

2.2殺蟲劑亞致死劑量對甜菜夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響

從圖2中的結果可以看出,經辛硫磷亞致死劑量LC20處理后甜菜夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性在72 h內持續降低,始終低于對照,24 h時比對照下降了24.87%,差異顯著;48 h時對照的酶活性下降幅度略大于辛硫磷處理,二者間差異不顯著;到72 h時差異又達顯著水平,這種動態變化說明,辛硫磷處理后甜菜夜蛾體內乙酰膽堿酯酶活性處于動態變化中。經溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后甜菜夜蛾幼蟲乙酰膽堿酯酶活性在24 h時與對照相差不大,之后的酶活性略低于對照,但差異不顯著。可見,辛硫磷對甜菜夜蛾幼蟲體內的乙酰膽堿酯酶具有顯著的抑制作用,而溴氰菊酯沒有明顯的抑制作用。

2.3殺蟲劑亞致死劑量對甜菜夜蛾幼蟲谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響

由圖3可以看出,經辛硫磷亞致死劑量LC20處理后,甜菜夜蛾幼蟲谷胱甘肽S-轉移酶活性在72 h內持續下降,均低于對照,24 h時比對照降低了12.21%,經溴氰菊酯亞致死劑量LC20處理后,甜菜夜蛾幼蟲谷胱甘肽S-轉移酶活性在24 h時降到最低,比對照降低了30.46%,之后出現上升趨勢,但是仍低于對照。經差異顯著性分析,兩種藥劑處理與對照間均達顯著水平。辛硫磷處理對谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響始終大于溴氰菊酯,其中,24 h和72 h時差異顯著。

3小結與討論

乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內重要的生化標記物,可以利用其活性變化監測殺蟲劑對昆蟲的亞致死效應,目前在亞致死狀態下殺蟲劑對昆蟲體內AChE的時間效用研究較少。本研究結果表明,辛硫磷亞致死劑量對甜菜夜蛾AChE的活力存在抑制作用,這與亞致死劑量的辛硫磷對棉鈴蟲AChE活性沒有誘導增加作用,反而使其活性下降一致[13]。而溴氰菊酯雖然在48 h后也表現出了一定的抑制作用,但抑制作用并不顯著,這可能與乙酰膽堿酯酶不是擬除蟲菊酯類的作用靶標有關,試驗中表現出的抑制作用是由什么原因導致仍需進一步的研究。

谷胱甘肽S-轉移酶是催化親電子物質與內源還原型谷胱甘肽(GSH)結合的一類酶,在昆蟲對殺蟲劑的解毒中起著重要作用。本研究結果顯示,亞致死濃度的辛硫磷和溴氰菊酯對甜菜夜蛾谷胱甘肽S-轉移酶均有抑制作用,這與高希武等[14]用亞致死劑量的滅多威處理后3齡棉鈴蟲的 GST活性下降是一致的,但是用亞致死劑量的對硫磷處理 3齡棉鈴蟲幼蟲24 h后,發現GST活性與對照組沒有顯著差異。Rumpf等[15]用氯氰菊酯亞致死劑量處理褐蛉幼蟲后,發現其GST活性明顯增加,而用苯氧威亞致死劑量處理后GST活性卻明顯降低。這說明亞致死劑量的不同殺蟲劑對不同昆蟲的GST活性的影響可能存在差異,有關不同殺蟲劑對不同昆蟲的GST活性影響的生物化學和分子生物學機制有待進一步研究。

兩種藥劑亞致死劑量處理對甜菜夜蛾CarE有一定的抑制作用,這與高希武等[14]用對硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、滅多威和溴氰菊酯等亞致死劑量處理棉鈴蟲48 h后其CarE比活力明顯降低的研究結果基本一致。唐培安等[16]研究發現甲酸乙酯對米象成蟲CarE的影響表現為先抑制后誘導的作用,這說明亞致死劑量的不同殺蟲劑對不同昆蟲的CarE活性的影響可能存在差異。李騰武等[17]的研究也表明,不同藥劑對同種昆蟲羧酸酯酶的抑制作用不同,同一種藥劑對不同種群的抑制作用也不相同,關于藥劑對羧酸酯酶具體影響的機理需要進一步的研究。

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