月季玫瑰遺傳轉化系統的研究進展

邢瀚文 季 靜 王 罡 杜長城 楊少輝 宋英今

摘要:對近年來月季和玫瑰遺傳轉化體系的建立和遺傳轉化研究進展進行了簡要綜述,為它們建立高效遺傳轉化體系奠定了理論基礎。

關鍵詞:月季;玫瑰;植株再生;遺傳轉化

中圖分類號:S685.12文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.004

Advances in Genetic Transformation Systems of Roses

XING Han-wen1,JI Jing1,WANG Gang1,DU Chang-cheng2,YANG Shao-hui1,SONG Ying-jin1

(1.College of Agriculture and Bioengineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China;2.Tianjin Forestry Bureau,Tianjin 300061,China)

Abstract:System establishment and researches of genetic transformation of rose in recent years were reviewed in this article, in order to lay a theoretical foundation for the establishment of efficient genetic transformation system of rose.

Key words:Chinese rose;plant regeneration;genetic transformation

月季( Rosa hybrida L.) 和玫瑰(Rosa rugosa)都是薔薇科薔薇屬植物,是世界上最重要的觀賞植物之一,世界四大切花之一,也是各類高級食品、化妝品的重要香料原料,因而具有極高的商業價值。目前,月季和玫瑰育種是花卉育種較活躍的領域,主要集中在對花色、花形、開花習性、鮮切花壽命、株型、抗病性等的改良上[1]。但是傳統的育種方法存在著諸如:為多年生灌木,育種所需時間較長;基因資源有限,染色體數目及倍性差異使遠緣雜交難以成功;生長一致性、開花同時性等多基因控制性狀難以改良等問題。

20世紀90年代發展起來的以組織培養為基礎的轉基因技術為月季和玫瑰育種提供了一條新途徑。這種方法不但使品種在外源基因所控制的性狀上發生改變,其性狀保持相對穩定,還可利用來自其他生物類型的基因,創造更優良的品種[2]。筆者著重介紹了月季遺傳轉化體系的建立及遺傳轉化方面的研究進展,為進行月季基因工程改良,培育月季優秀新品種提供借鑒。同時,玫瑰與月季在遺傳轉化方面非常相似,在此不再贅述。

1月季遺傳轉化體系的建立

月季遺傳轉化體系的建立是轉基因技術的重要前提條件,轉基因成功與否在很大程度上依賴于再生體系是否高效。植株再生可通過器官發生途徑和體細胞胚發生途徑實現,依據是否經過愈傷組織階段進一步分為直接再生和間接再生兩種[2]。目前可以通過直接再生、間接再生、體細胞胚再生等方法建立月季遺傳轉化體系[3]。

1.1直接再生

Lloyd等[4]在僅含有BA和NAA的培養基上直接從桃子(R. persica×R. xanthina)的葉和根,金英子(R.1aevigata)和光葉薔薇(R.wichuraiana)的葉上誘導出不定芽,但未報道誘導率。Dubois和de Vries等[5]報道在1/2MS + TDZ 6.8 μmol/L + NAA 0.27 μmol/L的培養基上,可從葉片直接再生不定芽,切花月季品種不同,分化情況不同。這是目前所報道再生率最高,需時最短的再生方法。最大發生率是在葉片基部和葉鞘基部,加入AgNO3可以縮短不定芽發生時間,提高不定芽再生頻率。再生率越高的品種,再生所需時間越短,不定芽生長越快,且再生芽數也越多,并且田間苗較組培苗的效果好。

1.2間接再生

芽體再生主要以根、節間、葉片、葉柄等為外植體,但對這方面的研究報道并不多。誘導愈傷的基本培養基為MS、SH、N6等,激素有BA、GA、2,4-D、NAA、KT等。誘導芽體的基本培養基有MS、1/2MS、改良MS培養基等,激素有BA、NAA等。誘導不定芽再生率通常不高,并且非常受基因型的限制,具有器官發生能力的愈傷組織也無法繼代增殖,因此,此再生途徑的應用有一定的局限性。

1.3體細胞胚再生

多以葉片、節間、雄蕊花絲、根和合子胚等為外植體。品種不同,外植體不同,對愈傷組織的誘導、體細胞胚的發生以及再生植株的形成有重要影響。品種,即基因型是最重要的影響因素,一些月季品種在目前的研究中沒有獲得再生。Noriega和Sondahl指出體細胞胚再生過程中重要的一步是從初級體細胞胚上誘導和保持脆性胚性愈傷組織,低水平的NAA/ZT(玉米素)有利于誘導,而高水平的NAA/ZT有利于保持。

影響體細胞胚再生的培養條件有溫度、光照等。體細胞胚發育前期適當的低溫培養(4～8 ℃)有利于體細胞胚的萌發,同時還需要生長素和細胞分裂素。Dohm等[6]報道體胚的萌發是零星發生的,Kim等[7]報道的體胚萌發率為11%。為提高萌發效率采取的措施主要是強光照、低溫和ABA處理。Yokoya等[8]采用ABA和低溫聯合處理,并使用麥芽糖代替蔗糖,通過胚的萌發和不定芽的再生,使25%的體細胞胚成苗。

2月季的遺傳轉化研究

目前,月季轉化系統大多采用胚性愈傷組織或體細胞胚進行轉化,但其再生系統還不夠完善,主要表現為再生率不高,且明顯受基因型限制。因此,月季轉基因的報道還很有限。

鄭玉梅等目前用于月季轉化的報告基因有新霉素磷酸轉移酶(nptⅡ)基因、β-葡萄糖酸苷酶(GUS)基因、熒光酶素(LUC)基因、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因。通過利用報告基因可以進行轉基因植株的快速檢測。目的基因有rol抗菌基因、抗幾丁質酶基因、抗菌蛋白基因、CHS基因等。

月季遺傳轉化的方法主要是農桿菌介導法。Firoozababy等(1991)首次成功地進行了農桿菌介導的月季轉化。他們以月季一品種(R.hybrida cv.Royalty)為供試材料,將其胚性愈傷與含有pnos NPT II/p35S LUC質粒的致瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404或與含有pnos NPT II/p35SGUS質粒的發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenesis) 15834共培養,得到了很高的轉化愈傷頻率,即每克愈傷約產生40～60個獨立的抗卡那霉素愈傷,通過LUC或GUS和PCR技術檢測,幾乎100%的抗性愈傷為轉化愈性。農桿菌菌株及質粒種類對轉化影響不大,根癌農桿菌LBA4404 或發根農桿菌15834 的轉化效率無顯著差異,根癌農桿菌GV3101、EHA105 和GV2260也都有成功報道,但農桿菌的預培養及共培養時間對轉化效率有一定影響。Dohm等[9]報道使用根癌農桿菌EHA105 和GV2260 時,搖菌時間不應超過2 h,共培養時間分別為2 d和6 d。共培養的結果是得到了再生的轉基因植株。2004年,Kim等[10]將綠色熒光蛋白基因運用農桿菌介導法成功轉化月季,并得到Southern 雜交分析驗證。以上結果表明農桿菌菌株及質粒種類對轉化影響不大,但農桿菌的預培養及共培養時間對轉化效率有一定影響。

除農桿菌介導法外,還有基因槍法。Marchant等[11]以胚性愈傷組織細胞為對象,通過轉化GUS報告基因,將基因槍法的轉化條件進行了優化。此后他又成功地將來自水稻的幾丁質酶基因轉入月季一品種(R.hybrida ‘Glad Tidings ),使該品種月季黑斑病的發生率降低13%～43%,抗病效果與幾丁質酶基因的表達量呈正相關[12]。

目前,月季轉基因植株再生方法多用體細胞胚再生。報告基因檢測、聚合酶鏈式反應檢測、South雜交法、North雜交法等分子生物學方法用于檢測基因是否在轉基因月季細胞中存在并表達。之后還要進行生物學鑒定,以確定外源基因能否正常的表達性狀,并穩定地遺傳給后代。

3展望

近年來在月季和玫瑰的組培和轉化方面雖然取得了較大的進展,但只有少數品種建立了高效再生體系,轉基因多數還停留在報告基因轉化的水平,外源基因在轉基因植株中表達和穩定性的報道不多,至今未有在生產中推廣的轉基因月季和玫瑰品種。而月季原產我國,我們擁有許多優良種質資源和基因資源,對一些具有商業價值的月季品種進行組培再生系統的研究,及應用轉基因方法對月季的花色、花期、鮮切花壽命等進行研究,完全可能培育出具有商業價值和有自主知識產權的新月季品種[13]。

參考文獻:

[1] 黃善武.月季育種[M]//程金水.園林植物遺傳育種學.北京:中國農業出版社,2000:385-401.

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[3] 鄭玉梅,馬神,劉青林.月季遺傳轉化研究進展[J].中國生物工程雜志,2003,23(2):79-82.

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[9] Dohm A,Ludwig C,Schilling D,et al. Transformation of roses with genes for antifungal proteins[J].Acta Horticulturae, 2001, 547: 27-34.

[10] Kim C K,Chung J D,Park S H,et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the green fluorescent protein (GFP) gene[J].Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2004,78:107-111.

[11] Marchant R,Power J B,Lucas J A,et al. Biolistic transformation of rose(Rosa hybrida L.)[J].Annals of Botany,1998,81:109-114.

[12] Marchant R,Davey M R,Lucas J A,et al. Expression of a chitinase transgene in rose(Rosa hybrida L.)reduces development of black disease(Diplocarpon rosae Wolf)[J].Molecular Breeding,1998(4):187-194.

[13] 李美茹,李洪清,孫梓健,等.月季的組織培養和基因轉化研究進展[J].廣西植物,2003,23(3):243-249.