常用分子標記在月季種質鑒定和育種中的應用

胡寶剛 季 靜 王 罡 杜長城 楊少輝 宋英今

摘要:介紹了幾種常用分子標記及其在月季的遺傳圖譜構建、種質資源分類鑒定、分子標記輔助育種、品種注冊和專利保護等諸多方面的應用。

關鍵詞:分子標記;月季;種質鑒定;育種

中圖分類號:S685.12文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.003

Applications of Common Molecular Markers in Germplasm Identification and Breeding of Chinese Rose

HU Bao-gang1,JI Jing1,WANG Gang1,DU Chang-cheng2,YANG Shao-hui1,SONG Ying-jin1

(1.College of Agriculture and Bioengineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China;2.Forestry Bureau of Tianjin,Tianjin 300061,China)

Abstract:In this paper, several commonly used molecular markers were introduced, and its applications in the building of genetic map of Chinese rose, germplasm identification, molecular marker-assisted breeding, registration of varieties and patent protection, and many other aspects were summarized.

Key words:molecular markers;Chinese rose;germplasm identification;breeding

月季(Rosa hybrida L.)為薔薇類多年生木本植物,每年多次開花,其花色絢麗多彩,花型豐富。月季切花為世界四大切花支柱之一,它不僅種類繁多,而且用途廣泛,可提取香料,花瓣可腌制食品,還可作藥用。月季花種類主要有小月季、月月紅、變色月季、切花玫瑰、藤蔓月季、大花月季、豐花月季、微型月季等。分子標記通常指在生物個體之間或群體之間可遺傳并可檢測的具有差異的DNA 序列,分子標記技術在月季種質資源鑒定和輔助育種中具有重要應用。

1分子標記技術及其在月季種質資源分類鑒定中的應用

近二十年來,分子標記技術迅速滲入到生物學科的各個領域,廣泛應用于生物的遺傳多樣性、親緣關系分析、種質資源鑒定及分類、遺傳圖譜構建以及分子輔助育種等方面,并顯示出獨到的優勢。李冬梅等[1]就分子標記在花卉種質資源研究中的應用作了簡要綜述。目前,國內外很多學者已經利用各種分子標記技術對月季的種質資源分類鑒定進行了卓有成效的研究。

1.1RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)標記

RFLP即限制性片段長度多態性,是Grodzicker等于1974年發明的分子標記技術,它是最早發展的分子標記技術,廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物的進化和分類關系研究,在月季種質鑒定應用中國內外已有報道。Ballard等[2]對22個月季品種進行了RFLP和RAPD標記分析,鑒定出了其中的20個月季品種。分析結果表明,所有以抗病和感病為親本的4倍體月季品種都表現出較高的遺傳多態性,并發現以抗病和感病親本雜交的后代適合遺傳圖譜的建立。Poncet等[3]通過RFLP標記分析感冠癭病的月季無性繁殖植株,指出月季植株主要是通過砧木材料傳染而感冠癭病的。Kaminska等[4]對12個品種的48個代表性的月季植株進行了RFLP分析,結論表明,其中的11個感病品種都為星狀植物菌原體中的16SrI-B侵染所致。可以預料,RFLP技術將在月季種質資源鑒定及遺傳育種領域中發揮更重要的作用,并能有力地促進月季品種的鑒定和改良。

1.2SSR(Simple Sequence Repeats)標記

SSR即簡單重復序列,是1982年Hamade發現的第二代DNA分子標記。SSR是月季種質資源鑒定和檢測圖譜構建多態性的一種有效方法。Baydar等[5]利用AFLP和SSR標記對土耳其生長的大馬士革月季進行了遺傳關系分析,結果表明供試的所有月季植株均來自于無性繁殖的同一原始基因型。Rusanov等[6]利用SSR分子標記,揭示了古老的大馬士革薔薇品種與精油月季品種在基因型、遺傳型上的相似性關系。同時Rusanov等[7]又對15個不屬于大馬士革薔薇的產油月季品種進行了SSR分析,結果表明多數品種與大馬士革薔薇有著間接的遺傳關系,但其中1個生長于保加利亞的品種在遺傳上更接近于麝香薔薇和白薔薇(Rlalba)。Zhang等[8]利用SSR標記技術對兩張已建的4倍體月季遺傳圖譜進行了整合,設計的SSR引物對中,多態性比例為57%。SSR標記在月季品種分類、雜種鑒定等方面的應用前景十分廣闊。

1.3RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)標記

RAPD即隨機擴增多態性DNA,是1990年由美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等發明的利用隨即引物擴增尋找多態性DNA片段的分子標記方法。RAPD標記是一種簡單有效的鑒定月季品系的技術。Gallego等[9]利用RAPD標記鑒定了25個月季品種,結果表明其品種內無變異性,品種間存在高度的變異。巢陽等[10]利用RAPD技術對28個月季品種和2個薔薇品種進行了遺傳多樣性分析,從145個引物中篩選出12個,其中3個引物從30個材料中擴增出3個品種特異的RAPD分子標記,利用篩選出的12個引物擴增出的65條多態性片段作了聚類分析,對這些月季品種的親緣關系和進化作了有意義的探討。Mahnaz Kiani等[11]利用RAPD標記分析鑒定了來自伊朗和保加利亞不同培養條件下的41個大馬士革月季,31個引物中有11個具有明顯的多態性,伊朗大馬士革月季廣泛的遺傳變異性表明伊朗是該品種的遺傳多樣性的中心,研究結果將在未來月季育種中發揮重要作用。

1.4AFLP(Amplified fragment length polymorphism)標記

AFLP即擴增片段長度多態性,是1993年由荷蘭科學家Zabeau和Vos等發明的一項專利技術。AFLP是RFLP和PCR結合的產物,該技術的獨特之處在于所用的專用引物可在不知道DNA信息的前提下就可對酶切片段進行PCR擴增。AFLP在月季的種質鑒定研究中是一種十分理想有效的分子標記,它能將品種從其半同胞和全同胞品種中鑒別出來。Kaufmann等[12]建立了用于繪制薔薇基因物理圖譜和定位克隆的玫瑰BAC文庫,發現圍繞Rdr1的區域至少有5個TIR-NBS-LRR家族的抗性基因相似物,存在一簇抗性基因,為Rdr1基因的分離、鑒定及其它園藝性狀基因的物理圖譜和定位克隆提供了很好的工具。Leus等[13]對88個月季野生種和栽培品種作了AFLP分析,結果證明在野生種和栽培品種間存在較大的差異。Anne等[14]對魁北克特有的兩個月季品種進行了AFLP、ISSR和RAPD分析,結果表明,這兩個月季品種與另一分布廣泛的月季品種實屬同種。Koopman等[15]研究了適用于重建月季品系關系的AFLP標記,指出AFLP標記作為一種重建薔薇科復雜關系的工具發揮著重要意義。

2分子標記輔助選擇月季育種

分子標記輔助選擇是將分子標記應用于植物品種改良過程中進行選擇的一種輔助手段。其基本原理是利用與目標基因緊密連鎖或表現共分離關系的分子標記對選擇個體進行目標區域以及全基因組篩選,從而減少連鎖累贅,獲得期望的個體。

自Rajapakse等1992年首先報道了RFLP在月季中的應用以來,分子標記作為一種對傳統的、不夠準確的形態描述的有效補充手段,引起許多育種家的興趣。Rajapakse等[16]采用AFLP技術建立了2個4倍體月季的遺傳連鎖圖,將控制葉柄上刺的基因定位在連鎖群7的末端,控制蘋果酸脫氫酶位置的基因定位在連鎖群4的中部,這為改進現代四倍體月季的輔助標記選育提供了初始依據。對高度雜合的月季,分子標記輔助選擇的應用具有特殊意義,在新品種的鑒定和保護育種者產權方面發揮重要作用。Yan等[17]利用AFLP、SSR、RFLP和SCAR等標記構建了月季高密度整合圖譜,為月季的作圖和分子標記輔助選擇育種描繪了廣闊的前景。Dugo等[18]利用133個標記,其中包括RAPD標記130個,SSR標記2個,形態標記1個,對灌叢諾塞特(Blush Noisette)和光葉薔薇(R wichuriana Crep)的雜交后代月季進行了遺傳圖譜的構建,并進行了QTL位點分析,共定位了13個與園藝性狀相關的QTL位點(花徑相關的位點為4,花期為2,葉徑為5,抗白粉病為2),這為今后的分子輔助選擇提供了有用的信息資源。

利用分子標記不僅可以定位目標基因,也可利用與目標基因緊密連鎖的分子標記追蹤目標基因。因此,應用分子標記對月季進行輔助選擇育種,將起到事半功倍的作用,如月季抗病育種中抗性材料的選擇需要創造特殊環境進行篩選鑒定,不僅育種時間長,而且受許多條件限制,而分子標記輔助選擇不受環境條件的影響,且有些分子標記分析手段快速、簡便、結果準確。月季在長期的自然選擇、人工栽培條件下形成的大量品種,可通過分子標記的分析進行系統分類,建立遺傳圖譜,明確親緣關系,指導育種工作;而且結合屬內種間的資源分析,有利于更多優良性狀的利用,豐富其遺傳基因。分子標記的發展使得在DNA水平上進行遺傳變異的研究成為可能,在育種實踐中,對某性狀的選擇,可以遠在該性狀表現出來之前通過分子標記進行選擇。分子標記輔助選擇與傳統的表型選擇相比,可以獲得更大的遺傳進展,尤其對低遺傳力性狀、限制性狀和后期表達的性狀,能增大選擇強度,縮短世代間隔,提高選擇的準確率。

3結語

分子標記技術在月季上的應用,有助于推動其遺傳基礎、起源與進化、品種分類、鑒定和育種等基礎科學的發展,從而更好地指導實踐工作,更好地開發、利用和保護月季資源多樣性。在研究方向上,我們應從分子水平上對其中具有重要特性的古老品種和現代品種進行比較研究,對其親源關系和起源問題作出分析,改進和完善目前的月季分類法,解決生產上急需的新品種鑒定、新品種培育等問題。同時應開展月季種質親緣遺傳關系、抗性遺傳等特異性狀基因分子標記的研究,利用分子標記技術標記定位和分離出具有重要性狀的目的基因,為轉基因的實現奠定基礎,并最終建立轉育特異性狀的分子標記輔助選擇(MAS)系統。月季作為世界重要的觀賞花卉,我們期待不久的將來分子標記技術在月季基因組計劃中發揮更重要的作用,它將推動我們對月季野生種質資源的研究和利用,為目標優良性狀基因從野生資源向現代月季漸滲提供可靠的遺傳信息,為自主知識產權新品種的創造奠定完備的技術平臺。

參考文獻:

[1] 李冬梅,朱根發,葉慶生.分子標記在花卉種質資源研究中的應用(綜述)[J].亞熱帶植物科學,2005,34(4):71-75.

[2] Ballard R, Rajapakse S, Abbott A, et al. DNA markers in roses and their use for cultivar identification and genome mapping [J]. Acta Horticulturae, 1996, 424:265-268.

[3] Poncet C, Bonnet G, Pionnat S, et al. Spread of crown gall disease in rose cultures[J]. Acta Horticulturae, 2001, 547: 75-81.

[4] Kaminska M, Sliwa H. Firs treport of phytoplasma belonging to apple proliferation group in roses in Poland [J].Plant Disease, 2004, 88(11): 1283.

[5] Bardar N G, Baydar H, Debener T. Analysis of genetic relationships among Rosa damascene plants grown in Turkey by using AFLP and microsatellite markers[J]. Journal of Biotechnology, 2004, 111(3): 263-267.

[6] Rusanov K, Kovacheva N, Vosman B, et al. Microsatellite analysis of Rosa damascene Mill: Accessions reveals genetic similarity between genotypes for rose oil production and old Damask rose varieties[J].Theor Appl Genet, 2005,111:804-809.

[7] Rusanov K, Kovacheva N, Atanassov A, et al. Microsatellite analysis of oil-bearing roses which do not belong to the species Rosa damascena Mill[J].Bulgarian Journal of Agricultural Science, 2005,11(1):1-9.

[8] Zhang L H, Byrne D H, Ballard R E, et al. Microsatellite marker development in rose and its application intetraploid mapping [J]. J Am Soc Hortic Sci,2005,131:380-387.

[9] Gallego F J, Martinez I. Molecular typing of rose cultivars using RAPDs[J]. Journal of Horticultural Science, 1996, 71(6): 901-908.

[10] 巢陽, 翁曼麗. 月季種質鑒定和多樣性分析[J].園藝學報, 2002, 29(6): 551-555.

[11] Mahnaz Kiani, Zabihollah Zamani, Ahmad Khalighi, et al. Wide genetic diversity of Rosa damascena Mill. germplasm in Iran as revealed by RAPD analysis[J]. Scientia Horticulturae,2008, 115 (4): 386-392.

[12] Kaufmann H, Mattiesch L, Lorz H. Construction of a BAC library of Rosa rugosa Thunb.and assembly of acontig spanning Rdr1,a gene that confers resistance to black spot[J]. Molecular Genet Genomics, 2003, 268(5): 666-674.

[13] Leus L, Jeanneteau F, Huylenbroeck J van, et al Molecular evaluation of acollection of rose species and cultivars by aflp, ITS, rbcL and matK[J].Acta Horticulturae, 2004, 651(2): 141-147.

[14] Anne Bruneau, Simon Joly, Julian R, et al. Molecula rmarkers indicate that the narrow Quebec endemics Rosa rousseauiorum and Rosa williamsii are synonymous with the widespread Rosa blanda[J].Canadian Journal of Botany, 2005,83(4): 386-398.

[15] Koopman W J M, Wissemann V, De Cock K, et al. AFLP markers as a tool to reconstruct complex relationships: A case study in Rosa (Rosaceae)[J].American Journal of Botany, 2008, 95(3): 353-366.

[16] Rajapakse S, Byrne D H, Zhang L, et al. Two geneti clinkage maps of tetraploidroses[J].Theor Appl Genet, 2001, 103(4): 575-583.

[17] Yan Z, Denneboom C, HattendorfA, et al. Construction of an integrated map of rose with AFLP, SSR, PK, RGA, RFLP, SCAR and morphological markers[J].Theor App. Genet, 2005, 110: 766-777.

[18] Dugo M L, Satovic Z, Millan T, et al. Genetic mapping of QTLs controlling horticultural traits in diploid roses[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2005, 111(3): 511-520.