4種食源性致病菌多重PCR檢測技術的研究及應用

趙 新 王 永 蘭青闊 朱 珠 程 奕

摘要:為建立一種利用多重PCR技術檢測和鑒定沙門氏菌(Salmonellla spp)、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的方法,根據沙門氏菌侵襲力蛋白A基因(invA gene)、單核細胞增生李斯特菌蛋白轉錄調控基因(prfA gene)、金黃色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蠟樣芽孢桿菌的促旋酶B亞單位基因(gyrB gene)設計引物,進行多重PCR擴增,并對多重PCR反應體系進行優化。在此基礎上建立了4種致病菌的多重PCR檢測體系,同時以國標法進行對比驗證。結果表明,本研究建立的多重PCR檢測方法簡單、快速、靈敏度高,具有很好的應用前景。

關鍵詞:食源性致病菌;多重PCR;檢測

中圖分類號:TS207.4文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.002

Study and Application on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by Multiplex PCR

ZHAO Xin, WANG Yong, LAN Qing-kuo, ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300381,China)

Abstract:In order to establish a rapid, sensitive and specific detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Salmonellla spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using multiplex PCR, according to invasion protein A gene(invA gene)of Salmonellla spp, transcriptional regulatory protein gene (prfA gene) of Listeria monocytogenes, autolysin gene (alt gene) ofStaphylococcus aureus and gyrase B subunit gene (gyrB gene) of Bacillus cereus, four pairs of specific primers were designed for multiplex PCR amplification. The multiplex PCR system and conditions of the amplification were optimized to make four kinds of food-borne pathogens have better amplification results. The results showed that the multiplex PCR method was rapid, specific and sensitive compared with national standard method. The multiplex PCR method developed in this study could provide an informative supplement to conventional microbiological methods for routine monitoring of food.

Key words:food-borne pathogenic bacteria; multiplex PCR; detection

農產品在采集、加工、運輸、銷售等環節容易受到微生物的污染,因此,微生物檢測是農產品及其加工品衛生檢測中的一項重要內容,而食源性致病菌檢驗是微生物檢驗的重中之重,關系到消費者的生命財產安全[1]。

致病菌是能夠引起人類及動物發生疾病、造成生命和財產巨大損失的一群微生物(主要是細菌),其中最為典型的致病菌是沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、空場彎曲桿菌和蠟樣芽胞桿菌[2,3],而包括中國在內的許多國家對這些致病菌的檢驗大多沿用傳統的細菌培養及鑒定方法,檢驗步驟繁瑣,檢驗周期長,同時對于有些細菌仍無法給出正確的鑒定,不符合農產品及加工品現代檢測要求[4]。

本研究旨在利用多重PCR技術建立同步檢測和鑒定沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌等主要食源性致病菌的快速、簡便、靈敏度高的方法,以期克服傳統致病微生物檢測方法的諸多缺點,得到與國標方法一致的檢測結果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株的選擇與培養乙型副傷寒沙門氏菌CMCC(B)50094、單核增生李斯特氏菌CMCC(B)54003、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、蠟樣芽胞桿菌CMCC(B)63301均為本室保存。菌株復蘇后接種于相應的增菌培養基中過夜培養。

1.1.2主要試劑和儀器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、Mg2+等購自Promega公司,高速冷凍離心機為Backman公司產品,凝膠電泳設備為BIO-RAD Power200及Power1000,PCR擴增儀為Thermo PX2,凝膠成像系統為SYNGENE公司產品。

1.2方法

1.2.1引物的設計與合成根據沙門氏菌invA靶基因、單核增生李斯特菌prfA靶基因、金黃色葡萄球菌alt基因、蠟樣芽胞桿菌gyrB的基因序列,設計出擴增這4種致病菌特異性核酸片段的PCR引物,引物設計情況見表1。

1.2.2細菌DNA的提取取過夜菌液2 mL,13 200 r/min離心5 min,棄上清。沉淀中加入567 μL TE緩沖液,30 μL 10%SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K,混勻后37 ℃溫育1 h。加入80 μL CTAB/NaCl和100 μL 5 moL/L NaCl,65 ℃,10 min。加入等體積氯仿異戊醇混勻,13 200 r/min離心10 min,取上清液加等體積酚/氯仿,13 200 r/min離心5 min,取上清液加0.6倍異丙醇,離心70%乙醇洗沉淀,待沉淀自然風干加50 μL去離子水溶解,備用。

1.2.3多重PCR反應條件的優化分別以4種菌的DNA為模板,對PCR反應條件優化。循環參數為94 ℃預變性7 min,94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環;最后72 ℃延伸7 min。通過預實驗發現退火溫度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶濃度、dNTPs濃度對PCR結果影響較大,因此,對反應體系中這些重要參數需進行多重PCR優化實驗。

1.2.4靈敏性試驗將4種菌的DNA做10倍遞增稀釋,并采用上述PCR方法擴增,觀察靈敏度。

1.2.5添加靈敏度實驗取經高溫滅菌的牛奶樣品各6 mL,分別同時接種1,10,100 CFU/mL的4種菌懸液各1 mL,同時以不接種病原菌的牛奶作陰性對照,加入90 mL優化培養基中,30 ℃培養14 h。取2 mL增菌液提取DNA進行多重PCR檢驗。

1.2.6多重PCR方法和國標方法對樣品檢測結果的比較對30份生鮮牛乳、30份奶牛場土壤樣品及22份市售散裝茶葉樣品同時應用多重PCR和國標方法進行檢測。

2結果與分析

2.1PCR反應條件的優化

以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單核增生李斯特氏菌的DNA為模板對PCR退火溫度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶濃度、dNTPs濃度進行優化。優化后的多重PCR反應條件為:10×PCR緩沖液2.5 μL,Mg2+濃度2.4 mmol/L, Taq酶濃度6 U,600 μmol/L dNTPs。引物濃度為:沙門氏菌80 nmol/L、單核增生李斯特氏菌80 nmol/L、金黃色葡萄球菌80 nmol/L、蠟樣芽胞桿菌160 nmol/L。循環參數為:94 ℃預變性7 min,94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環,最后72 ℃延伸5 min,優化后電泳結果見圖1。

2.2靈敏性試驗

將供試菌株DNA經10倍梯度稀釋后,在上述優化的多重PCR條件下,檢測沙門氏菌、單核增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌DNA的敏感性分別為3.13,2.88,9.98,24.2 ng,見圖2。

M:DL2 000;1～7:沙門氏菌DNA質量依次為313 ng,31.3 ng,3.13 ng,313 pg,31.3 pg,3.13 pg,313 fg;李斯特菌DNA質量依次為288 ng,28.8 ng,2.88 ng,288 pg,28.8 pg,2.88 pg,288 fg;金葡DNA質量依次為99.8 ng,9.98 ng,998 pg,99.8 pg,9.98 pg,998 fg,99.8 fg;蠟樣DNA質量依次為242 ng,24.2 ng,2.42 ng,242 pg,24.2 pg,2.42 pg,242 fg

圖2 多重PCR檢測靈敏度

2.3添加靈敏度實驗

應用多重PCR方法進行檢測,結果見圖3。從圖中可以看出,多重PCR檢測人為接種沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌的牛奶樣品敏感性可達到0.1 CFU/mL,金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的牛奶樣品敏感性可達到1 CFU/ mL,見圖3。

1:空白對照;2:陰性對照;3:陽性對照;4～6:牛奶同時含沙門菌、金葡菌、李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌菌量依次為0.1,1,10 CFU/mL:M:DL2 000

圖3 人為接種病原菌牛奶樣品的多重PCR檢測敏感性

2.4多重PCR法和國標方法對樣品檢測結果比較

如表2所示,在所檢測的82份樣品中,國標方法和本研究所建立的方法均檢出41份沙門菌陽性、63份金黃色葡萄球菌陽性、12份李斯特氏菌陽性、12份蠟樣芽孢桿菌陽性,結果完全一致。

3結論

多重PCR引物設計過程中不僅要考慮其特異性,而且要盡量使多對引物的退火溫度一致,并且避免同對引物或多對引物之間形成引物二聚體。本試驗在引物設計時使各引物的退火溫度保持在53 ℃左右,4對引物之間不存在3′端配對,并盡可能地減少引物之間多個連續堿基的同源性,相對減少了引物二聚體的出現機率[5]。在多重PCR反應中,由于金黃色葡萄球菌擴增片段較大,相對不易擴增,采用降低退火溫度、增加循環參數的方法,可有利于大片段引物的擴增[6]。

本研究建立的多重PCR方法將傳統方法中大量的生化試驗轉化為一次性擴增,具有操作簡便、快速、靈敏度高等特點,便于批量檢測,而常規培養方法需要7 d或更長的時間,不宜大批量操作,因此,使用本方法做樣品初篩,結合國家標準或行業標準可大大縮短檢測周期,降低檢驗成本,更加適應公共衛生事件應急處理快速反應的需要,更加符合農產品及加工品現代檢測的要求。

參考文獻:

[1] 劉家發,朱建如.食品安全存在的問題及對策[J].公共衛生與預防醫學,2005,16(6):35-38.

[2] 趙志晶,劉秀梅.食品樣品中大腸桿菌O157:H7復合PCR檢測方法的研究[J].衛生研究,2004,33(6):716-719.

[3] Barbara M L, Tony C B, Grahame W G. The microbiological safety and quality of food[M]. Gaithersburg, Maryland, USA: Aspen publishers, 2000:374-886.

[4] 王永,趙新,蘭青闊,等.四種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測技術研究[J].天津農業科學,2009,15(1):13-15.

[5] Henegariu O, Heerema N A, Diouhy S R, el al. Multiplex PCR: Critical parameters and step-by-step protocol[J].BioTechniques, 1997, 23:504-511.

[6] 夏穎哲,張春光,陳宜瑜,等. 福爾馬林保存魚類標本中大片段DNA的提取[J].水生生物學報,2007,31(4):485-491.