健脾化瘀方對人肝癌細胞ras/MAPK通路的影響

【摘要】 目的 研究健脾化瘀方對人肝癌細胞ras/MAPK信號通路相關基因表達的影響。方法 采用RTPCR法，用凝膠電泳分析系統比較目的基因與βactin基因的吸光度比值來反映基因的表達。結果 ERK、SOS1、cfos基因表達降低(P<0.05)， MEK、raf、ras、Grb2基因的表達未見明顯差異(P>0.05)。結論 健脾化瘀方能通過抑制ras/MAPK信號通路的上ERK、SOS1、cfos的表達，從而起到抑制肝癌細胞的生長，誘導細胞凋亡的作用。

【關鍵詞】 健脾化瘀方;RTPCR;ras/MAPK

文章編號:1003-1383(2009)05-0513-03

中圖分類號:R 587.2文獻標識碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2009.05.001

Effect of Jianpi Huayu Recipe on ras/MAPK pathway of human hepatoma cell [HJ1*2][HJ]

ZOU Xi1，WANG Ruiping1，ZHAO Jiang2

(1.Jiangsu Province Hospital of TCM，2.Nanjing University of TCM，Nanjing Jiangsu，China 210029)

【Abstract】 Objective To study the effect of Jianpi Huayu Recipe on ras/MAPK signaling pathway of human hepatoma cell.

Methods The gene expression was represented byabsorbance ratio of target gene and βactin gene with RTPCR method and gel electrophoresis analysis system.Results ERK，sos1，cfos gene expression were lower， while there was no significant difference in MEK，Raf，Ras，Grb2 gene expression.Conclusion The Jianpi Huayu Recipe can inhibits the growth of the human hepatoma cell and induce the apoptosis by inhibiting the expression of gene ERK，sos1，cfos of the ras/MAPK signaling pathway.

【Key words】 Jianpi Huayu Fang;RTPCR;ras/MAPK

細胞外刺激引起細胞反應是通過細胞內信號傳導途徑來實現的。MAPK是一類特殊細胞信號傳導蛋白，經上游激酶作用后發生蘇氨酸、絲氨酸雙位點磷酸化而激活[1]。是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者[2]，參與介導生長、發育、分裂、分化、死亡以及細胞間同步功能等多種細胞過程。該信號傳導通路基本的信號傳遞步驟遵循MAPKs的三級酶促級聯反應，該通路的激活可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[3]。MAPK信號轉導通路也被認為是許多信號通路的共同通道[4]。我們的前期實驗研究表明，健脾化瘀方能明顯抑制人肝癌細胞SMMC7721的增殖，誘導人肝癌細胞的凋亡，因此，研究健脾化瘀方對人肝癌細胞ras/MAPK信號通路相關基因表達的影響，是探索健脾化瘀方治療肝癌機制的有效手段之一。本實驗主要觀察健脾化瘀方對ras/MAPK信號傳導通路上相關基因表達的影響。

資料與方法

1.細胞及藥物 人肝癌細胞株SMMC7721由南京中醫藥大學細胞實驗室提供。中藥制備:黃芪10 g、白術4 g、苡仁10 g、茵陳5 g、半枝蓮5 g、重樓5 g、丹參5 g、郁金5 g、白芍5 g、全蝎1 g，共55 g，用550 ml蒸餾水加熱回流提取2次，每次1小時，合并提取的藥液，微波真空干燥。配制成相當于生藥濃度1 g/ml的藥液滅菌備用，實驗時配制為6 mg/ml濃度。

2.實驗方法

(1)細胞準備:取處于對數生長期的人肝癌細胞SMMC7721，以5×105個/ml密度接種于直徑6 cm的培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h以使細胞貼壁，棄原培養液，加入健脾化瘀方終濃度為6 mg/ml的含10%小牛血清的DMEM培養液，繼續培養48 h后，用PBS洗2次，每皿加1 ml trizol，反復吹打后收集細胞于EP管中。立即使用或-70℃保存待用。以對數生長期肝癌細胞SMMC7721為對照。

(2)RNA制備:每皿1 ml Trizol提取的細胞后，每ml加入200 μl氯仿，靜置10 min后離心，取上清移至新EP管，加入等體積異丙醇，室溫放置 10 min后離心，棄上清沉淀即總RNA。每管加入1 ml 75%乙醇(用DEPC處理過的水配制)，離心5 min倒掉乙醇，室溫晾干，加入20 μl DEPC處理水，吹打混勻，隨即使用或-70℃保存待用。

(3)RNA質量鑒定:取2 μl RNA加入500 μl DEPC水中，在紫外分光光度儀上測定RNA樣品在260 nm和280 nm處的吸光度(OD)值。OD260與OD280比值在1.8～2.0之間，表明無RNA降解。2%瓊脂糖凝膠40～60 V預電泳10min后，60 V電壓電泳至溴酚藍遷移到凝膠的3/4處;紫外燈下觀察18 S和28 S帶情況，可見28 S的寬度及亮度約是18 S的兩倍，邊緣清晰，表明完整性較好，可用于RTPCR。

(4)逆轉錄:采用TaKaRa逆轉錄試劑盒，按照說明書操作。37℃孵育15 min，85℃ 5 s滅活反轉錄酶，4℃ 結束，取出低溫保存。

(5)聚合酶鏈式反應:采用TaKaRa PCR試劑盒，按照說明書操作。擴增條件:94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環32次(SOS1:94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環32次)。RTPCR引物設計見表1。

(6)電泳凝膠分析:2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓55 V，時間35 min。采用Tanon GIS2010凝膠成像分析系統對瓊脂糖凝膠進行吸光度掃描，測量條帶的灰度強弱。結果以目的基因和βactin的積分吸光度比值表示。以上實驗均重復3次。

表1 RTPCR實驗引物設計

3.統計學分析 統計分析采用SPSS13.0軟件包進行數據處理，所有數據均用均數±標準差(-±s)表示，采用t檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

結果

健脾化瘀方對人肝癌細胞株SMMC7721作用48 h后，通過RTPCR和凝膠電泳，利用凝膠電泳成像分析系統掃描條帶的積分吸光度值，并與同管擴增的βactin條帶積分吸光度做比值，代表基因表達的量。實驗結果為:ERK、SOS1、cfos基因表達較對照組低，ERK、SOS1各濃度組與對照組比較差異有顯著的統計學意義(P<0.01)，cfos高濃度組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05);見表1。MEK、Raf、Ras、Grb2基因的表達與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。凝膠電泳圖見圖1。

表2 健脾化瘀方作用肝癌細胞后相關基因產物凝膠電泳條帶吸光度比值

(-±s，n=3)

討論

MAPK經典的信號轉導過程包括:細胞外信號→酪氨酸蛋白激酶受體(receptor protein tyrosine kinase，RPTK/RTK)→含有SH2結構域(Scr homology 2 domain)的接頭蛋白(如GRB2)→鳥嘌呤核苷酸釋放因子(如son of sevenless，SOS)→Ras蛋白→絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK，如Raf)→絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK，如MEK1/2)→MAPK(如ERK1/2)→轉錄因子→DNA合成。MAPK 家族包括ERK、JNK和p38MAPK。其中ERK在MAPK途徑中不僅作為轉錄因子， 而且是膜蛋白。ERK的激活使轉錄因子磷酸化來調節基因的表達， 促進細胞增殖， 阻止細胞凋亡。當細胞受到外界刺激后，可通過激活ERK激酶1( MEKl)，進而使ERK1/2磷酸化活化，使之由胞漿轉位到核內，激活其下游底物，主要是介導一些編碼核轉錄因子的早期反應基因(如原癌基因cfos，cmyc，cjun和Erg1等)的活化調控細胞生長反應。導致次級反應基因(如ANF基因、MHC基因、MLC2基因等)的異常表達，影響細胞的功能。

SOS屬于GEF(鳥苷酸交換因子)家族成員，SOS具有雙重功能:一是作為接頭蛋白，以自身的富含脯氨酸(Pro或P)結構域與Grb2的SH3區結合，使SOS活化;二是具有催化功能，使其下游分子小G蛋白Ras激活。活化的Ras再作用于下游靶蛋白Raf，使之活化(即磷酸化)。Raf即MAPKK激酶或MAPKKK，它是MAPK級聯反應的第一個分子，從而啟動了MAPK的三級級聯激活。

cfos基因屬于即時早期基因(immediate early gene)在細胞生長的靜止期基本不表達，外界因素如血清EGF，PDGF，TGF，TNFa等均可誘導cfos的表達。研究顯示cfos基因與腫瘤發生密切相關[5，6]。在肝內膽管癌形成過程中，cfos蛋白表達逐漸增高，在肝內膽管癌組織中cfos蛋白表達最強。提示cfos蛋白高表達與肝內膽管癌發生發展密切相關，cfos基因的激活可能是肝內膽管癌發生的早期分子事件，并參與癌變的全過程。

本實驗研究表明，健脾化瘀方作用人肝癌細胞株SMMC7721后，ERK、SOS1、cfos基因的表達下降，表明健脾化瘀方可能通過抑制ras/MAPK信號通路的上ERK、SOS1、cfos的表達，從而起到抑制肝癌細胞的生長，誘導細胞凋亡的作用。

參考文獻

[1]Rosen LB，Greenberg.MEK Stimulation of growth factor receptor signal transduction by activation of voltage sensitive calcium channels[J].Proc-Natl-Acad-Sci USA，1996，93:1113-1118.

[2]Farnsworth CL，Freshney NW，Rosen LB，et al.Calcium activation ofras mediated by neuronal exchange factor ras-GRF[J].Nature，1995，376:525-527.

[3]Klemke RL，Cai S，Ginanini AL，et al.Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase[J].J Cell Biol，1997，137(2):481-92.

[4]曹 亞.細胞周期與腫瘤[J].國外醫學.生理病理科學與臨床分冊，2002，22:103-105.

[5]Willing AE，Berthoud HR.Gastric distension-induced c-fos expression in catecholaminergic neurons of rat dorsal vagal complex[J].Am J Physiol，1997，746(1-2):195-206.

[6]柏素云，李冠武，張立民，等.RAS/MAPK通路在食管癌中的活化改變及其意義[J].國際檢驗醫學雜志，2006，27(9):771-773.

(收稿日期:2009-09-07 修回日期:2009-10-08)

(編輯:潘明志 英文審校:鐘京梓)