香菇多糖的過氧化氫脫色工藝研究

陳 健,耿安靜,徐曉飛,2

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640; 2.南方李錦記有限公司,廣東廣州 510620)

香菇多糖的過氧化氫脫色工藝研究

陳 健1,耿安靜1,徐曉飛1,2

(1.華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州 510640; 2.南方李錦記有限公司,廣東廣州 510620)

為了脫除香菇多糖液中的色素,以過氧化氫 (H2O2)為脫色劑,選擇脫色時間、脫色溫度、pH和過氧化氫的質量百分比濃度等因素為實驗因素,進行單因素實驗,以此為基礎進行 4因素 3水平的正交實驗。結果表明,在脫色時間 3h、溫度 55℃、pH7和過氧化氫的質量分數為 7%的脫色條件下,可以有效地去除香菇多糖液中的色素。過氧化氫脫色時間短,香菇多糖保留率高,脫色效果優于樹脂。

香菇多糖,過氧化氫,脫色,分子量

香菇多糖(lentinan,LNT)是從傘菌科真菌香菇(lentinus edodes)的子實體中分離到的一種β-1, 3-葡聚糖,具有廣泛的藥理活性,如免疫調節作用、抗腫瘤[1-4]、抗衰老作用、提高免疫和刺激干擾素形成、對化學物質所致肝損傷具有保護作用以及作為LAK細胞活性向上調節劑(LURA)等,已成為當前研究的熱點。本研究以過氧化氫為脫色劑,考察脫色時間、脫色溫度、pH和過氧化氫濃度等因素對多糖脫色效果的影響,還考察了過氧化氫的脫色過程對多糖分子量的影響,并比較了過氧化氫脫色和樹脂脫色效果,為多糖的分離純化和香菇的開發利用提供理論與實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

香菇粗多糖液 由南方李錦記有限公司提供,實驗室自制;葡聚糖標準品 Dextrans Standand系列Mp=4400、9900、21400、43500、1248000、196000、277000、401000、1285000Da Sigma公司;雙蒸水實驗室自制;濃硫酸、重蒸苯酚、濃鹽酸、氯化鈉、無水乙醇、正丁醇、氯仿、H2O2、磷酸二氫鉀等 均為分析純。

JA2003N精密電子天平 上海精密科學儀器有限公司;N-1001旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;AnkeTGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;DBS-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠;DE-310冷凍干燥器 德國威思公司; BT-200B數顯恒流泵;凝膠滲透色譜(GPC)系統 美國 waters公司,Waters1525 Binary HPLC Pump、Waters 717 plus Autosampler、Waters 2414 Refractive Index Detector;數據處理系統 Breeze(V3.3)GPC工作站。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫色樣品液的制備 香菇→水提噴霧干燥→得香菇多糖粉末→稱量→溶解→乙醇沉淀→sevag法除蛋白→得香菇粗多糖溶液→放置于 4℃的冰箱里備用

1.2.2 單因素脫色條件的確定 影響過氧化氫脫除多糖液色素的重要因素有脫色時間、脫色溫度、溶液pH和過氧化氫的濃度等因素。

根據預實驗確立因素水平表(表 1),每個處理各取 10mL粗多糖液,于恒溫水浴鍋中脫色,在 420nm處用可見分光光度計測定溶液色素的吸光度,以脫色率作為實驗指標,脫色率的計算公式為：

脫色率 =(脫色前的吸光度 -脫色后的吸光度)/脫色前的吸光度。

表1 因素水平表

1.2.3 過氧化氫脫色正交實驗 在確定最佳單因素條件的基礎上,選擇 L9(34)表進行 4因素 3水平的正交實驗,以確定脫色的最佳方案。以脫色率作為實驗指標,實驗方案如表 2所示。

表2 正交因素水平表

1.2.4 樹脂脫色工藝 按照文獻[5]的方法對樹脂進行預處理。取香菇粗多糖溶液,在 420nm測定其吸光度,用已處理的樹脂在 45℃的恒溫水浴中靜態吸附脫色 3h后,再測定其吸光度,計算脫色率。

1.2.5 香菇多糖的純化流程

1.2.5.1 過氧化氫脫色后的多糖純化流程 香菇粗多糖溶液→過氧化氫脫色→過DEAE纖維素柱 (水洗脫)→濃縮→冷凍干燥→GPC測定分子量

1.2.5.2 717陰離子交換樹脂脫色后的多糖純化流程 香菇粗多糖溶液→717陰離子交換樹脂脫色→過DEAE纖維素柱(水洗脫)→濃縮→冷凍干燥→GPC測定分子量

1.2.6 香菇多糖分子量分布的 GPC表征 按照文獻[6]的色譜條件和測定方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 時間對過氧化氫脫色的影響

用過氧化氫脫除多糖液色素時,原糖液加入10%的 H2O2溶液,在 45℃水浴中脫色 0.5、1、3、6、9h,脫色時間對多糖液的脫色實驗結果如圖 1所示。

圖1 時間對過氧化氫脫色的影響

由圖 1可以看出,隨著時間的延長,過氧化氫的脫色率逐漸增加,但到 3h以后,脫色率增加得很緩慢。從 0.5h到 3h,脫色率增加了 20.48%,但從 3h到6h,脫色率增加了 5.97%,從 6h到 9h,脫色率只增加了 4.22%。為此,選擇 3h為最佳的脫色時間。

2.2 過氧化氫濃度對脫色效果的影響

糖液加入一定質量分數的過氧化氫脫除多糖液色素,在 45℃的水浴中脫色 5h,其結果如圖 2所示。

圖2 過氧化氫濃度對脫色的影響

由圖 2可以看出,隨著過氧化氫濃度的增加,脫色率逐漸增加。當濃度由1%提高到10%,脫色率提高 15.9%,由 10%提高到 15%,提高的幅度是 6.4%,由 15%提高到20%時,脫色率僅提高 2.8%,可見,盡管隨著過氧化氫的濃度的增加,多糖的脫色率增加,但增加得很平緩,增加的速度很小。考慮到脫色率、成本和降解等因素,實際情況下取 10%作為最大濃度。

2.3 溫度對脫色效果的影響

用過氧化氫脫除多糖液色素時,原糖液加入10%的過氧化氫溶液,采用 35、45、55、65、75℃等脫色溫度對多糖液的脫色 6h實驗,結果如圖 3所示。

圖 3 溫度對H2O2脫除多糖色素的影響

由圖 3可以看出,隨著溫度的升高,過氧化氫的脫色率逐漸增加,但當溫度升高到 55℃時,脫色率增長幅度開始變得很緩慢。當溫度從35℃提高到55℃時,脫色率提高 23.13%,從 55℃提高到 75℃,脫色率只提高 5.39%,考慮到香菇多糖在高溫條件下容易降解,選擇 55℃為脫色溫度。

2.4 pH對脫色效果的影響

加入 pH為 4、6、7、8、10的緩沖液于香菇多糖溶液中,再加入10%的過氧化氫溶液,在55℃恒溫水浴中脫色 6h,測定脫色前后的糖液的吸光度,計算脫色率,其結果如圖 4所示。

由圖 4可知,在酸性條件下,隨著 pH上升,脫色率開始時緩慢增加,而后迅速增加,當 pH接近 7時,達到峰值,隨后下降。考慮到酸性和強堿的條件下,多糖易降解,實際選擇的 pH條件在中性附近。

2.5 過氧化氫脫色正交實驗結果

脫色時間、脫色溫度、pH和過氧化氫的加樣量等綜合因素對多糖液的脫色效果及極差分析結果見表3。

圖4 pH對過氧化氫脫色的影響

表 3 多因素影響過氧化氫脫除多糖液色素的正交實驗結果

由表 3的極差分析可以看出,各因素對過氧化氫脫色影響順序為A＞D＞B＞C,即時間為最重要因素,其次為 pH、加樣量和溫度。理論優化方案為A3B1C1D3,即脫色溫度為 55℃、時間為 3h、pH為 7,過氧化氫的質量分數為 7%,該條件下過氧化氫的脫色效率最高。

2.6 不同方法脫色所得的香菇多糖的比較

圖 5中L1和L2分別為由 717陰離子交換樹脂脫色工藝和過氧化氫脫色 (3h,7%,55℃,pH7)及后續純化后獲得的香菇多糖分子量 GPC圖。

圖 5 不同方法脫色對香菇多糖分子量的影響

可以表 4和圖 5可知,經 717陰離子交換樹脂脫色后,所得的香菇多糖 L1的重均分子量 (Mw)是 28945Da,多分散性為 2.40,而經過過氧化氫脫色后,所得的香菇多糖的重均分子量 (Mw)是 25967Da,多分散性分別 2.11。二者分子量和峰形狀均比較接近,表明經優化的過氧化氫脫色工藝對香菇多糖分子量影響不大,對香菇多糖的降解作用小。

表4 L1與L2的GPC分子量數據

表 5 樹脂與過氧化氫的脫色效果的比較

從表 5可知,用 717樹脂脫色,脫色率要比過氧化氫脫色方法高出 4.1%;但多糖的保留率要低24.3%。用過氧化氫脫色所得的香菇多糖外觀好,而且工藝簡單,多糖保留率高。

3 結論

綜上所述,為了探索用過氧化氫脫除香菇多糖色素的適宜條件,在脫色時間、脫色溫度、pH和過氧化氫的加樣量等單因素實驗的基礎上,設計上述 4因素 3個水平的正交實驗方案,實驗結果經極差分析發現,適宜的脫色條件是脫色時間 3h、脫色溫度55℃、pH7、過氧化氫的質量分數為 7%。香菇多糖經過氧化氫短時間脫色后,不僅脫色率高,而且分子量也沒有大的變化。通過比較樹脂和過氧化氫脫色的效果、工藝等,過氧化氫除了無麻煩的預處理和再生、環保、脫色率高以外,多糖的保留率高。因此,過氧化氫脫色比樹脂脫色更具有優勢和廣闊的運用前景。

[1]Chihara G,Maeda Y,Hamuro J,et al.Inhibition of mouse sarcom a 180 by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.) Sing[J].Nature,1969,222(5194)：687-688.

[2]Chihara G,Hamuro J,Maeda Y,et al.Fractionation and purification ofthe polysaccharides with marked antitumour activity,especially lentinan,from Lentinus edodes(Berk.)Sing [J].Cancer Research,1970,30：2776-2781.

[3]Takuma Sasaki,Nobuo Takasuka.Futher study of the structure of Lentinan,an Antitumor Polysaccharide from Lentinus edodes [J].Carbohydrate Research,1976,47(1)：99-104.

[4]袁靜 .香菇多糖的抗腫瘤作用[J].上海醫院藥學,1999,10 (1)：29-32.

[5]王元鳳,金征宇 .茶多糖脫色的研究[J].食品與發酵工業, 2004,20(12)：60-65.

[6]金鑫,賴鳳英 .仙人掌多糖的提取、分離純化及 GPC法測定其分子量[J].現代食品科技,2006(2)：138-140,149.

Study on decolorizing technology of lentinan by hydrogen peroxide

CHEN Jian1,GENG An-j ing1,XU Xiao-fei1,2
(1.College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.NanfangLee Kum Kee Co.,Ltd.,Guangzhou 510620,China)

In orde r to decolorize the lentinan,hyd rogen p e roxide was used to be reagent for decolorizing it,and the t im e,temp e ra ture,pH as we ll as m ass frac tion of hyd rogen p e roxide we re se lec ted to be fac tors for the exp e r im ent of s ing le fac tor,then the orthogona l tes t w ith four fac tors and three leve ls was ca rried out on the aforem entioned bas is.The results showed tha t the p olysaccha ride was decolorized effec tive ly unde r the cond itions which the t im e was3h,the temp e ra ture was a t55℃,the pH was7and the m ass frac tion of hyd rogen p e roxide was7%.The decolora tion t im e by hyd rogen p e roxide was shorte r,and the re tention ra te of lentinan was highe r.In b rief,the decolora tion effec t by hyd rogen p e roxide was be tte r than by res in.

lentinan;hyd rogen p e roxide;decolorize;m olecula rwe ight

TS201.2

B

1002-0306(2010)03-0293-03

2009-03-25

陳健(1967-),男,博士,副教授,主要從事天然產物化學、糖分析等方面的研究工作。