香蕉凝集素基因雙啟動子表達

摘要：為了獲得香蕉果實特異表達的強啟動子，利用PCR方法將2個凝集素(BanLec)基因啟動子串聯在一起，置換植物表達載體pBI121上的35S啟動子，構建BanLec基因雙啟動子攜帶gus植物表達載體pBIL3，用基因槍轉化香蕉葉片、根系和果實薄片，瞬時表達結果顯示BanLec基因串連的雙啟動子依然表現為果實特異性表達，而且表達量明顯高于BanLec基因單啟動子及35S啟動子，證明該串連的雙啟動子是一個在香蕉果實中特異表達且表達量較高的強啟動子。

關鍵詞：香蕉；凝集素基因：雙啟動子；果實特異表達

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-422-04

香蕉果實是利用轉基因方法生產重組藥用蛋白、肽或有價值的化合物的理想生物反應器，研究者們期望插入的抗原基因能夠特異地在香蕉果實中表達，從而使香蕉果實變成口服疫苗，這就要求有果實組織特異性啟動子。已報道的香蕉轉基因研究中用到的啟動子有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，玉米泛素蛋白啟動子(Ubi)，水稻肌動蛋白啟動子(Actin)。這些啟動子均為組成型啟動子，它們不能實現目的基因在特定組織、特定時間表達。因此克隆適宜于香蕉遺傳轉化的果實組織特異性啟動子是把香蕉作為口服疫苗的基礎。近年來國內外研究者在香蕉中分離到了一些果實的特異表達的啟動子，如ACC氧化酶基因的啟動子和ACC合成酶基因的啟動子，但未見在轉基因中應用的報道。作者于2005年克隆了香蕉凝集素基因(BanLec gene)啟動子，通過基因槍法對香蕉根、葉、果實的瞬時表達進行研究，證明Lectin啟動子是一個果實高效特異表達的啟動子，其表達活性稍高于35 S啟動子，轉化番茄研究也證實為果實特異高效表達啟動子，已獲國家發明專利授權(專利號：ZL200410092468.4)。在此基礎上，我們構建了該啟動子的串聯表達載體，通過gus瞬時表達研究其活性，期望能夠獲得香蕉果實特異表達的強啟動子，為香蕉果實作為植物生物反應器，生產藥用蛋白或者藥用成分提供一個優良的啟動子。

1 材料和方法

1．1 材料和試劑

材料香蕉(Musa spp.AAA group，cv.Brazilian)果實采自熱帶作物生物技術研究所實驗基地。

化學試劑購自華美公司，載體pBIl21、pBIL2、大腸桿菌Escherichia coli DH5a、農桿菌GV3103本實驗室保存。

1．2 方法

1．2．1 BanLec基因雙啟動子片段擴增及植物表達載體(pBIL3)構建根據BanLec基因啟動子序列測序結果分析內切酶位點，針對該序列設計2對相同的PCR引物并分別加上相應的酶切位點：引物1：

以pBIL2質粒為模板(pBIL2是本實驗室構建的Banlec基因單啟動子植物表達載體，由Banlec基因啟動子替換pBI121表達載體中35S啟動子構建而成)，分別以上述合成的引物進行PCR擴增反應。PCR產物分別用HindⅢ與Sal1、Sal1與BamHI酶切。回收2個PCR酶切片段用T4連接酶連接，連接產物連于T-vector上送上海生工公司測序。將測序的串列啟動子序列用HindⅢ與BamHI雙酶切，回收酶切產物：同時HindⅢ與BamHI雙酶切pBIl21載體，回收酶切后大片段。將回收的串聯啟動子片段與pBI121大片段連接。構建植物表達載體pBIL3，HindⅢ與BamHI雙酶切鑒定。

1．2．2 檢測基因槍法對香蕉果實薄片轉化pBI121、pBIL2及pBIL3的GUS活性 將香蕉果實用1‰氯化汞溶液浸泡10 min，用滅菌蒸餾水沖洗數次再將其徒手切成大小0.5 cm²、厚度0.5～1 mm的薄片；縱剖香蕉組培苗的根并將葉切為0.5～1 cm²小塊。將根、葉片和果實薄片均勻置于1/2MS培養基上室溫放置3 h，每皿約放置40塊，重復6皿。按照Jeffer-son等的方法。用pBIL3質粒DNA包被的微彈轟擊香蕉葉片、根和果實；pBI121質粒DNA和pBIL2質粒DNA僅轟擊香蕉果實薄片，將經過基因槍轟擊的香蕉果實薄片放置在1/2MS固體培養基上26℃暗培養48 h。然后進行組織化學染色和基因槍轟擊后48 h的轉化材料GUS活性比色測定，以GUS提取液中每mg總蛋白在1 min中生成對硝基苯酚的微摩爾數為1個酶活單位。

以光吸收值A595對BSA濃度作圖，制得標準曲線，測得各轉化材料Gus提取液得A595，根據標準曲線計算樣品蛋白含量。

2 結果與分析

2．1 串聯雙啟動子的植物表達載體(pBIL3)構建

串聯啟動子序列經測序表明，按照設計要求將我們所克隆的BanLec基因的啟動子通過內切酶Sal1成功串聯在一起(測序序列省略)。構建的含有香蕉BanLec基因串聯啟動子序列的植物表達載體pBIL3(圖1)，酶切鑒定表明載體構建成功。

2．2 串聯雙啟動子香蕉各器官GUS組織化學染色和比色法定量分析

GUS瞬時表達試驗結果顯示，pBIL3轉化后的香蕉根、葉中沒有觀察到藍色，也沒有檢測到gus的表達產物，pBIL3轉化后的香蕉果實切片肉眼及顯微鏡觀察均看到明顯的藍色斑點(圖2)，表明Ban，Lee基因雙啟動子串連體的表達也具有果實特異性，只在香蕉果肉中表達。而pBIL2和pBI121的GUS活性均小于pBIL3(圖3)，表明串連后的Ban，Lec基因啟動子不僅具有表達的特異性，而且比單

3 討論

轉基因植物能否成功應用很大程度上取決于啟動子驅動導人基因的表達水平。有研究認為2個串聯的CaMV35S啟動子可使uidA在擬南芥中表達水平比單個CaMV35S啟動子提高11倍：但也有研究顯示，35S雙啟動子驅使的uidA在煙草中發生高度沉默㈣。我們通過構建BanLec雙啟動子驅使gus瞬時表達表明，雙啟動子不僅保持其果實特異表達的特性，而且活性明顯高于單個的BanLec基因啟動子活性。

為了能更進一步提高BanLec基因啟動子的表達活性，通過PlantCARE軟件分析BanLec基因啟

4 結論

利用PCR方法將2個凝集素(BanLec)基因啟動子串聯在一起。構建GUS融合表達載體，基因槍法轉化香蕉的各種器官表明BanLec基因雙啟動子串連體的表達也具有果實特異性，僅在香蕉果肉中表達，串連后的BanLec基因啟動子具有比單Ban—Lec基因啟動子和花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子更高的活性。因此，構建的該串連啟動子將在今后香蕉轉基因及在以香蕉果實為生物反應器的研究中具有一定的應用價值。