蘋果三倍體后代培養(yǎng)及倍性鑒定

摘要：以自然授粉的三倍體蘋果品種喬納金的種子為材料，研究了培養(yǎng)方式對(duì)蘋果三倍體實(shí)生后代獲得的影響及實(shí)生后代的倍性水平。結(jié)果表明，離體培養(yǎng)與常規(guī)播種在喬納金種子成苗率上存在明顯差異，其中離體培養(yǎng)的成苗率是48.1％，常規(guī)播種的成苗率是20.9％，離體培養(yǎng)獲得的植株是常規(guī)播種獲得的植株的2倍以上。本研究獲得的690個(gè)喬納金實(shí)生后代中以非整倍體植株占多數(shù)，共獲得非整倍體452株，占植株總數(shù)的65.5％。在后代中有13個(gè)為多倍體。其中離體培養(yǎng)獲得7株三倍體和4株四倍體，而常規(guī)播種只獲得2株三倍體，表明離體培養(yǎng)可以獲得較多的多倍體資源。喬納金實(shí)生后代中不同倍性植株在形態(tài)上差異顯著，根據(jù)植株形態(tài)和葉形指數(shù)，可以容易地將多倍體(三倍體、四倍體)植株與二倍體植株和非整倍體植株區(qū)分開來。

關(guān)鍵詞：蘋果；喬納金；三倍體實(shí)生后代；倍性水平；多倍體

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-400-04

蘋果是世界性果樹，其生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，果品營養(yǎng)價(jià)值高，耐貯性好，供應(yīng)周期長。目前栽培蘋果品種以二倍體為主，也有少許多倍體。多倍體果樹一般具有生長健壯、枝粗、葉厚、果大、少子或無子、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此，多倍體育種一直是果樹育種的一條重要途徑。人工誘發(fā)多倍體，特別是利用秋水仙素等化學(xué)藥物誘變，已在蘋果上取得了成功。但是，它只能把原有類型的染色體數(shù)目增加1倍，因而無論原來的類型是二倍體或是多倍體，誘變后都是偶數(shù)的多倍體。生產(chǎn)上應(yīng)用的蘋果多倍體多為三倍體，如果要培育三倍體品種，還要通過有性雜交過程。

有性雜交培育多倍體是當(dāng)今許多育種者的首選。三倍體品種在減數(shù)分裂過程中，所產(chǎn)生的配子絕大多是不育的，但可產(chǎn)生少量不同倍性的可育配子，因此，三倍體能夠直接產(chǎn)生不同倍性的整倍體，充當(dāng)不同倍性間橋的功能。Nilsson最早用三倍體的歐洲山楊與二倍體進(jìn)行雜交，獲得了一些三倍體、四倍體和混倍體植株。此后眾多研究表明，利用三倍體與二倍體雜交能夠獲得多倍體。Laubscher等檢測的884個(gè)蘋果三倍體實(shí)生后代的幼苗，只發(fā)現(xiàn)8株(0.9％)為多倍體。Einset在8個(gè)蘋果三倍體品種的5 694株實(shí)生苗中發(fā)現(xiàn)148株多倍體，約占2.6％，而且不同品種出現(xiàn)的頻率有很大差異，以赫布期特最高，達(dá)到4％。

我們以自然授粉的三倍體蘋果品種喬納金的種子為試材，將成熟胚離體培養(yǎng)與常規(guī)播種相比較，通過染色體計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)觀察等方法，對(duì)蘋果三倍體的實(shí)生后代植株進(jìn)行倍性鑒定，旨在建立新的蘋果多倍體育種體系和篩選出簡單、準(zhǔn)確的蘋果倍性鑒定方法。

1 材料和方法

1．1 植物材料

于2005年9月采集自然授粉的三倍體蘋果品種喬納金的成熟種子2 000粒，將其平均分成兩部分，一部分離體成熟胚培養(yǎng)，另一部分冬季層積并于春季露地播種。

1．2 胚接種

將蘋果種子放人100 mL三角瓶中，每瓶放100~150粒種子，依次用體積分?jǐn)?shù)70％乙醇浸泡30 s，質(zhì)量濃度0.1％升汞浸泡10-15 min，無菌水沖洗3次，在無菌條件下剝?nèi)シN皮，然后將完整的成熟胚接種在胚萌發(fā)培養(yǎng)基(F14+活性炭1.0 g/L+水解乳蛋白400 mg/L+抗壞血酸100 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖15g/L)上，在溫度(25±2)℃，黑暗或光照(光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時(shí)間為14 h/d)下培養(yǎng)。

1．3 胚培養(yǎng)、植株擴(kuò)繁和生根移植

成熟胚在胚萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)再生植株數(shù)，培養(yǎng)60 d后，將植株轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L)中，1個(gè)月左右繼代1次。當(dāng)每個(gè)株系增殖超過10株時(shí)，接種到生根培養(yǎng)基(1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L)中進(jìn)行生根。植株根系長到2～3 cm時(shí)，打開瓶口練苗3～7 d，然后移栽到日光溫室的營養(yǎng)缽中。溫室內(nèi)溫度在20～28℃，自然光照。光照時(shí)間約為12h/d。

1．4 種子的層積和播種

將陰干的喬納金蘋果種子放在清水中浸泡4～6 h，使其充分吸水，然后與3～5倍的濕河沙拌均，在2～5℃的暗室中進(jìn)行層積。2006年春季，當(dāng)有超過1/2種子胚根外露時(shí)進(jìn)行播種。將層積好的種子播種在72孔穴盤里，每穴1粒種子，播種后的穴盤置于同一個(gè)日光溫室內(nèi)，保證基質(zhì)濕度。播種后60 d統(tǒng)計(jì)植株數(shù)量。

1．5 植株倍性鑒定

上午10點(diǎn)左右從植株上剪取1 cm長的頂梢，用飽合對(duì)二氯苯水溶液在18℃下處理6-7 h，在卡諾溶液固定2～24 h后用70％的乙醇保存。將樣品放在5 mol/L鹽酸溶液中解離2 min，用蒸餾水洗凈，取1 mm左右莖尖分生組織進(jìn)行壓片和染色，每個(gè)材料檢測分散好的分裂細(xì)胞30個(gè)。

1．6 植株的葉片形態(tài)和氣孔觀察

移栽到溫室營養(yǎng)缽中不同倍性的植株，從基部第3～5片起選取大小一致的葉測量長、寬。計(jì)算葉形指數(shù)，每個(gè)倍性植株至少測量30枚葉，求平均值。

每葉片隨機(jī)選取5個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)取0.01 cm²大小的葉塊。按照廖乾初等的方法對(duì)葉塊進(jìn)行預(yù)處理，然后用日立S-450掃描電鏡觀察葉片氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞大小。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同培養(yǎng)方式對(duì)喬納金蘋果種子成苗率的影響

采用離體成熟胚培養(yǎng)和露地常規(guī)播種2種培養(yǎng)方式，對(duì)喬納金種子的成苗情況進(jìn)行研究。結(jié)果2種培養(yǎng)方法共獲得690個(gè)實(shí)生后代，其中離體培養(yǎng)獲得481株，常規(guī)播種獲得209株(表1)，成苗率分別是48.1％和20.9％。很明顯，在實(shí)生后代的成苗率上，離體培養(yǎng)方式是露地常規(guī)播種方式的2倍以上。

2．2 喬納金蘋果實(shí)生后代染色體數(shù)目觀察

蘋果染色體組中染色體數(shù)目是x=17，二倍體染色體數(shù)目是2n=2x=34，三倍體染色體數(shù)目是2n=3x=51，四倍體染色體數(shù)目是2n=4x=68。本試驗(yàn)對(duì)所有成活的喬納金蘋果實(shí)生后代株系進(jìn)行了莖尖染色體數(shù)目觀察，以確定其倍性水平。離體培養(yǎng)獲得的481株后代中有191株是二倍體，11株是多倍體，其余的是非整倍體；常規(guī)播種共獲得209株實(shí)生后代，其中有二倍體34株，多倍體2株，其余為非整倍體。2種培養(yǎng)方式除了在實(shí)生后代的獲得數(shù)量上有明顯差異之外。在實(shí)生后代的倍性水平也有一定的差異，離體培養(yǎng)獲得了11株多倍體，其中有7株三倍體和4株四倍體，而常規(guī)播種只獲得2株三倍體植株而沒有四倍體植株。成活的非整倍體植株通過普通壓片法染色體數(shù)日觀察發(fā)現(xiàn)，染色體數(shù)目多在40條左右(圖版-A～D6)，沒有出現(xiàn)較大分離現(xiàn)象。

2．3 不同倍性蘋果植株外觀形態(tài)比較

從植株外觀形態(tài)觀察。本研究獲得的蘋果非整倍體植株生長弱小，葉片小而長(圖版-E1～E4)，與整倍體植株易于區(qū)別。喬納金蘋果實(shí)生后代中的三倍體和四倍體植株表現(xiàn)出多倍體植株的典型特征：生長健壯。枝條粗壯，葉片大而圓，粗糙，葉厚，葉邊鋸齒較多，節(jié)間較短。二倍體、三倍體、四倍體的葉形指數(shù)依次為1.88、1.44、1.41，二倍體與多倍體在葉片大小和葉形指數(shù)上差異顯著(表2)，易于從直觀上區(qū)別開來。三倍體與四倍體在植株外觀形態(tài)上和葉形指數(shù)上沒有明顯差異。

2．4 不同倍性喬納金實(shí)生后代植株氣孔比較

對(duì)葉片上的氣孔利用掃描電鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，多倍體的氣孔比二倍體和非整倍體的氣孔大得多；在氣孔密度上，多倍體小于二倍體和非整倍體(圖版-F1～F4)。從表3可以看出，多倍體的保衛(wèi)細(xì)胞長達(dá)到26 μm，寬達(dá)到32 μm：二倍體的保衛(wèi)細(xì)胞長、寬分別是14.86 μm和20.51μm；非整倍體的保衛(wèi)細(xì)胞長是10.97μm，寬是19.97 μm；在保衛(wèi)細(xì)胞大小上，多倍體是非整倍體的2倍左右，二倍體則位于2者之間，在5％水平上多倍體與二倍體和非整倍體之間差異顯著。在多倍體中的三倍體和四倍體之間氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞大小上沒有明顯差異。

3 討論

多倍體在自然界中早已存在，但自然產(chǎn)生多倍體的頻率很低。本試驗(yàn)獲得的690株喬納金實(shí)生后代植株中大部分為非整倍體植株，多倍體植株只有13株，占有較少的比例(不足2％)，這與前人的研究結(jié)果基本相同。本研究獲得的多倍體植株中有11株是通過離體培養(yǎng)獲得的，約占多倍體植株的85％，而且四倍體植株也是通過離體培養(yǎng)的方式獲得的，因此，應(yīng)用離體培養(yǎng)技術(shù)是提高蘋果三倍體實(shí)生后代中多倍體種質(zhì)資源獲得效率的重要途徑。

多倍體擁有巨大性，多年來已被許多學(xué)者所認(rèn)同。倍性水平與葉片氣孔大小和保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)量存在相關(guān)性。黃禮森等自1982年以來對(duì)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所的梨樹資源圃中的梨品種進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，多倍體品種在一些性狀上與二倍體有明顯的差異，與二倍體相比，多倍體表現(xiàn)在枝、葉、花、果都有巨大性。陳土炎等㈣對(duì)不同倍性茶樹品種的葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的觀察結(jié)果表明，不同倍性間保衛(wèi)細(xì)胞中的葉綠體數(shù)目差異比同倍性內(nèi)品種間的差異大得多，達(dá)極顯著水平。本試驗(yàn)的結(jié)果與前者的研究結(jié)果基本一致。

多倍體的鑒定工作一直是整個(gè)多倍體育種過程中的重要內(nèi)容。簡單、快速、準(zhǔn)確的鑒定方法能夠提高育種效率，降低育種成本。周元昌等以花培苗形態(tài)學(xué)鑒別法與DNA流式細(xì)胞儀測定法進(jìn)行比較，認(rèn)為若以DNA流式細(xì)胞儀測定法鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，苗期形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確率可達(dá)94.2％。王強(qiáng)生曾對(duì)利用花粉粒性狀鑒定果樹多倍體進(jìn)行了綜合評(píng)述，認(rèn)為利用花粉粒性狀可以進(jìn)行倍性鑒定。Peloquin等通過染色體計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確鑒定出雜種香蕉的倍性水平。劉仁祥等㈣認(rèn)為煙草植株染色體倍性的早期快速鑒定宜選用第5片葉，通過測其氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)間接鑒定倍性，可把鑒定時(shí)期提前到大田移栽前。三倍體后代中多倍體比例很低，如何快速、簡單地從為數(shù)眾多的實(shí)生后代中鑒定出多倍體植株對(duì)于蘋果多倍體育種具有重要的意義。本研究將染色體計(jì)數(shù)法的鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)指標(biāo)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，表明對(duì)于喬納金蘋果實(shí)生后代，不同倍性植株在外觀形態(tài)上差異顯著，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與染色體計(jì)數(shù)法的鑒定結(jié)果完全一致，表明形態(tài)學(xué)鑒定可以作為蘋果多倍體鑒定的充分依據(jù)，這對(duì)于多倍體育種中后代的早期選擇具有十分重要的意義。

4 結(jié)論

不同培養(yǎng)方式對(duì)蘋果三倍體實(shí)生后代獲得及實(shí)生后代的倍性水平有一定影響，離體培養(yǎng)獲得的植株是常規(guī)播種獲得的植株的2倍以上，且離體培養(yǎng)可以獲得較多的多倍體資源。蘋果二倍體、多倍體、非整倍體植株在形態(tài)上差異明顯，可以容易地將其區(qū)分開來。研究結(jié)果為蘋果多倍體育種后代早期選擇提供了簡單、準(zhǔn)確的方法。