槜李等１５個李品種Ｓ基因型鑒定及其多態性分析

摘要：利用李屬S-RNase基因特異性引物，對15個供試李品種進行PCR擴增，共獲得30個目的條帶。對這些目的條帶進行測序鑒定出15個李品種的S基因型。通過與NCBI中利用BLASTn與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB等數據庫中的序列比對，結果表明，其中9個為新S—RNases基因，對9個新，S-RNases核苷酸序列進行分析發現，位于高變區內的內含子大小為141～1758 bp，其同源性為33.9％(S-18-S-19)～81.6％(S-20～S-21)，表現出豐富的長度和序列多態性：編碼區的核苷酸序列比對結果，其同源性為73.3％(S-16-S-19)～91.7％(S-17～S-22)；其推導氨基酸序列相似性為67.3％(S-16～S-19)～89.1％(S-17～S-22)；包含李屬S-RNase一級結構所共有的C2、C3保守區和高變區(RHV)。系統進化分析表明，9個新，S—RNases與李屬其它樹種S—JRNases聚類在一起，歸屬為李亞科(Prunoideae)。

關鍵詞：李；自交不親和性；S-RNase基因

中圖分類號：S662.3 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-338-05

中國李(Prunus salicina Lindl.)屬配子體型自交不親和系統(Gametophytic self-incompatibility，GSI)，該系統受單一位點(S-10e118)的復等位基因所控制，該位點至少包含2種基因：花粉S基因和花柱，S基因。在正常情況下。同一品種自交或具有相同S基因型的不同品種間雜交表現不親和，不能結實，所以生產上需要配置授粉樹。如果不了解品種的，S基因型，在配置授粉品種時具有一定的盲目性。隨著分子生物技術的日益發展，根據薔薇科S-RNase的序列信息，人們在許多薔薇科樹種中利用PCR-RFLP及PCR方法進行了品種的S基因型鑒定工作，如在蘋果、梨、甜櫻桃、杏、扁桃、梅和李上均有報道。我們利用李屬S-RNase的保守序列設計引物對供試品種進行PCR特異性擴增，對獲得的特異片段進行回收、克隆、測序。為豐富李S基因的遺傳多態性、進一步研究自交不親和機理和自交不親和性基因演化奠定基礎；在生產實踐上，鑒定品種的S基因型可為李園配置合適的授粉品種提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料

供試品種豬血李、珍珠李、榜李、95-03、前坪、櫻桃李、福貢青皮李和西瓜李來自江蘇省農業科學院李品種園；寬甸大李、蘋果李、離核四號、秋李、新疆3號、郯城杏梅和美國大李來自遼寧熊岳杏李國家資源圃。春天采集供試品種幼嫩葉片放人凍存管。液氮處理。存于-70℃冰箱備用。

1．2 方法

1．2．1 基因組DNA提取利用改良的CTAB法提取供試品種的基因組DNA，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的純度和完整性，存于-20℃冰箱備用。

1．2．2 S-RNase基因的PCR擴增 利用李屬S—RNase的保守序列設計正向引物PruC2(5’-CTATGGCCAAGTAATTATTCAAACC-3’)和反向引物PruCE-R(5’-TGrlTFGTYCCATrCGCCTrCCC-3’)。引物序列由寶生物工程(大連)有限公司合成。反應體系和程序參照Ortega等的方法。應用PTC-200(BIO-RAD)擴增儀進行擴增。所用TaKaRa Ex-TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司。用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1．2．3 基因組DNA目的片段的回收、克隆和測序用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒[購自生工生物工程(上海)有限公司]回收目的片段，方法參照廠商說明書。將純化的目的條帶用TaKaRa pMD19-T載體[購自寶生物工程(大連)有限公司]克隆，方法參照廠商說明書。提取質粒由上海英駿公司進行測序。測序結果在NCBI中利用BLASTn與GenBank+EM—BL+DDBJ+PDB等數據庫的序列進行比對，并用DNAMAN軟件(version 5.2；Lvnnon Biosoft)進行序列分析。

2 結果與分析

2．1 李品種S基因型鑒定

根據李屬S-RNase基因的特異性引物，對15個供試李品種進行PCR擴增。共獲得30個目的條帶(圖1)。這些目的條帶在瓊脂糖凝膠上分布在300-2 000 bp，表現豐富的多態性。圖1顯示，蘋果李和寬甸大李，珍珠李和豬血李的2條目的條帶位置相似，福貢青皮李、櫻桃李、秋李、離核四號和美國大李中共有1條相似位置的目的條帶，西瓜李、槜李和美國大李、郯城杏梅中也分別共有1條相似位置的目的條帶。為進一步確定品種的S基因型，對這些目的條帶進行回收、克隆、測序，序列比對結果表明有21個目的條帶的核苷酸序列分別與S-a，S-e，S-h，S-k，S-i，S-7，S-8，S-10，S-11的核苷酸序列的相似性為100％，視為相同S-RNase基因：其中福貢青皮李、櫻桃李、秋李、離核四號和美國大李中共有S-11基因，大小為479 bp；95-03中大小與之相似的1條目的條帶與S-a基因的核苷酸序列同源性為100％，大小為458 bp，確定為S-a；西瓜李和槜李中共有S-h基因。其余9個目的條帶的核苷酸序列與數據庫中已知的李S-RNases基因的同源性低于

67.3％(S-16～S-19)～89.1％(S-17～S-22)，與其它已知李S-RNases基因的同源性為49，0％(S-c～S-22)～86.3％(S-e～S-20)。且具有李屬S-RNase一級結構所共有的C2、C3保守區和高變區(RHV)(圖2)。

3 討論

S-RNase基因特異性PCR方法在鑒定薔薇科植物的S-RNase基因中得到廣泛的應用。本實驗利用保守引物PruC2/PruCE-R對供試品種進行PCR擴增，新鑒定出9個S-RNases基因。這9個S－RNases基因具有與李屬其它物種的S-RNses一樣的序列結構特征。15個供試品種的S-基因型包含18個S-RNases基因，相同的S基因在不同的品種中出現，如S-11在離核四號、秋李、櫻桃李、福貢青皮李和美國大李中均有出現；Hal6sz等舊統計49個已鑒定李品種的S-基因型包含14個S-RNases基因且大部分品種的基因型由S_b和S_c。組成，表現出豐富的序列和遺傳多態性特點。因此，與表現配子體自交不親和性的其它物種一樣，采用PCR的方法可以快速便捷的鑒定李品種的S基因型。

寬甸大李與蘋果李(S-15/S-16)，離核四號與秋李(S-e/S-11)，珍珠李與豬血李(5-21/S-22)基因型兩兩分別相同。根據S基因型相同的品種間授粉不能結實的原理，在生產上應避免在寬甸大李與蘋果李、離核四號與秋李、珍珠李與豬血李之間不能相互配置授粉樹。因此，采用PCR的方法可以快速便捷的鑒定李品種的S基因型，進而可以有預見性地避免在，S基因型相同的品種間選擇授粉品種，給生產帶來損失。當然，在配置授粉樹時，除了考慮，S基因型外，還要考慮花期相遇、花粉直感、花粉量和花粉育性等問題。合理配置授粉品種還必須進行田間授粉驗證。比如，槜李是李的古老良種，果形碩大，皮色殷紅，芬芳異常，甘甜鮮美，名列諸李之冠。槜李栽培歷史雖長，但產量低是制約其推廣的主要因素。根據本研究結果，為解決槜李產量低，可給其配置另外14個品種中的任何一個具有不同S基因型的品種作為授粉樹。

基于neighbor—ioining方法對27個S-RNases進行系統進化分析。在薔薇科系統樹中，鑒定的9個S-RNases基因與李屬其它樹種S-RNases推導的氨基酸聚在同一個群體，歸屬李亞科，但未形成種一特異性亞群，而是與李屬其它樹種S-RNases隨機分布在李亞科群中。Wtlnsch等和Yaegaki等分別對甜櫻桃和梅的S-RNase進行系統進化分析，結果發現從屬李屬的S-RNases基因聚在同一個群體，歸屬為李亞科，但未形成種一特異性亞群，而是與李屬其它樹種S-RNases隨機分布在李亞科群中，在甜櫻桃和梅上驗證了薔薇科的S-RNase基因形成于亞科形成之后種形成之前的假說，本研究進一步驗證了此假說。

4 結論

利用S-RNase基因特異性PCR方法鑒定出15-個李品種的S基因型分別為：福貢青皮李(S-11/S-7)，95-03(S-27/S-a)，蘋果李(S-15/S-16)，寬甸大李(S-15/S-16)，櫻桃李(S-11/S-8)，西瓜李(5-k/S-h)，槜李(S-h/S-7)，珍珠李(S-21/S-22)，豬血李(S-21/S-22)，前坪(S-10/S-i)，秋李(S-e/S-17)，離核四號(S-e/S-11)，美國大李(S-11/S-20)，新疆3號(S-17/S-19)，郯城杏梅(S-18/S-20)。鑒定出的9個新S-RNases基因，位于高變區的內含子表現豐富的長度多態性，對其推導氨基酸序列進行比對發現其同源性為673％(S-16-S-19)～89.1％(S-17～S-22)，與其它已知李S-RNases基因的同源性為49.0％(S-c～S-22)～86.3％(S-e～S-20)，且具有李屬S-RNase一級結構所共有的C2、C3保守區和高變區(RHV)，對其系統進化分析進一步證明了S-RNase基因形成于亞科形成之后種形成之前的假說。