八棱海棠肌動(dòng)蛋白基因（ＭｒＡＣＴ）的克隆及分析

摘要：以八棱海棠(Malus micromalus Makino)為材料，抽取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法，5’-RACE獲得長(zhǎng)度1121 bp的片段、3’一RACE獲得883 bp的片段，再通過(guò)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到八棱海棠中一種肌動(dòng)蛋白基因的cDNA的全長(zhǎng)序列。該序列全長(zhǎng)1134 bp，推測(cè)其編碼377個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為5.16，其編碼的氨基酸與擬南芥(Arabidopsis thaliana)actin 7編碼的氨基酸只有2個(gè)氨基酸差別。通過(guò)對(duì)八棱海棠MrACT基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在不同組織中，該基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，本文為進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)，以MrACT基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，研究八棱海棠其他基因的豐度打好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：八棱海棠；肌動(dòng)蛋白基因；RACE：內(nèi)標(biāo)

中圖分類號(hào)：S661.19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-289-04

1963年我國(guó)科學(xué)家閻隆飛先生首先證明植物中存在肌動(dòng)蛋白Ⅲ。肌動(dòng)蛋白執(zhí)行著重要的生理功能，如參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞和細(xì)胞間的相互作用。actin基因是管家基因之一，在各種不同組織上恒定表達(dá) 。因而它可以用作分子內(nèi)標(biāo)來(lái)研究其它基因的表達(dá)差異。高等植物如水稻、擬南芥、煙草的肌動(dòng)蛋白序列已被測(cè)定，而八棱海棠的肌動(dòng)蛋白基因研究較少。作者旨在利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)，進(jìn)行八棱海棠actin基因克隆和測(cè)序，通過(guò)檢驗(yàn)該基因在不同組織中表達(dá)水平，試圖確證該基因作為內(nèi)標(biāo)基因的可能性，從而為研究八棱海棠其它基因的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

2．3 八棱海棠actin基因不同組織表達(dá)分析

將同一批抽取的八棱海棠RNA，按1.2.7中的方法同一批操作，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再根據(jù)克隆的八棱海棠的肌動(dòng)蛋白基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用熒光定量PCR技術(shù)研究八棱海棠actin在八棱海棠不同組織中的表達(dá)情況。從圖4中可以看出本次克隆到的八棱海棠actin基因在5種不同組織的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。

3 討論

大多數(shù)多細(xì)胞動(dòng)物包含少于10個(gè)的肌動(dòng)蛋白基因；許多真菌，原生動(dòng)物僅有一個(gè)或很少的肌動(dòng)蛋白基因：而矮牽牛的基因組中至少100個(gè)肌動(dòng)蛋白基因：大豆、煙草、土豆、水稻等也有許多肌動(dòng)蛋白基因。Hightower等㈣的研究表明，植物與動(dòng)物肌動(dòng)蛋白之間的氨基酸序列差異在11％～15％。植物的肌動(dòng)蛋白具有高度的保守性，植物肌動(dòng)蛋白一般由376～377個(gè)氨基酸殘基組成。根據(jù)本研究獲得的核苷酸序列推測(cè)的肌動(dòng)蛋白是由377個(gè)氨基酸殘基組成。許多植物的肌動(dòng)蛋白的研究結(jié)果表明，他們由復(fù)雜的基因家族編碼，該家族中一些高度保守的基因，可能追溯到微管植物的起源。植物的肌動(dòng)蛋白基因家族各成員具有高度保守的氨基酸組成，這與肌動(dòng)蛋白作為細(xì)胞骨架的保守功能是相一致的。

本文通過(guò)RACE技術(shù)獲得的八棱海棠的肌動(dòng)蛋白基因，豐富了肌動(dòng)蛋白研究的資料庫(kù)。通過(guò)對(duì)氨基酸序列比對(duì)繪制的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白在進(jìn)化上是比較保守的。理想的內(nèi)標(biāo)基因應(yīng)該滿足：(1)不存在假基因，以避免基因組DNA的擴(kuò)增。(2)穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，而且其表達(dá)量無(wú)顯著性差異等條件。通過(guò)八棱海棠不同組織的actin表達(dá)分析，其在不同組織的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，以期為進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)，以MrACT基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，研究八棱海棠其它基因的豐度打好基礎(chǔ)。