小型昆蟲蛋白圖譜檢測方法的比較研究

褚　棟　張柱亭　安志蘭　郭篤發　周洪旭

摘要：以煙粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]和溫室白粉虱[Trialeurodes vaporariorum(westwood)]小型昆蟲為研究對象，比較了這些小型昆蟲可溶性蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測方法。結果表明，改進的復合銀染法在蛋白質檢測中具有效果好、簡單快捷的特點。

關鍵詞：煙粉虱；溫室白粉虱；可溶性蛋白；復合銀染法

中圖分類號：Q 599

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術是蛋白質分析中最常用的手段之一。SDS-PAGE分離后的蛋白質條帶，通常用考馬斯亮藍進行染色，但是該方法靈敏度相對不高，背景較深。20世紀70年代產生了一種更為敏感的染色方法——銀染法。近幾年，又相繼報道了許多改進的銀染方法，包括二胺銀染法、無二胺銀染法、照相銀染法、負片銀染法、正片銀染法和海波銀染法。目前，對染色方法改進主要集中在如何提高蛋白質染色的靈敏度，操作方便與否，費用是否昂貴等方面。如何在保持銀染方法高靈敏度的同時，又能夠有效地降低染色背景，用無毒的化學物質去替換現在凝膠電泳中常用的有毒物質等，代表了蛋白質條帶染色的未來發展方向。

在昆蟲蛋白電泳染色方面，已有研究表明海波銀染法在家蠅幼蟲蛋白電泳中具有效果較好、簡便快速的特點。而對于小型昆蟲可溶性蛋白電泳檢測的染色方法報道較少，該方面的研究對于小型昆蟲物種鑒定、生理代謝等研究具有重要的實用價值。本研究以北方兩種小型昆蟲煙粉虱[Bemisia tabaci(Genadius)]和溫室白粉虱[Trialeurodes va po-rriorum(Westwood)]作為研究對象，分別使用了常規考馬斯亮藍染色法、海波銀染法、改進的復合銀染法(考馬斯亮藍染色后再用海波銀染法染色)3種方法進行了比較研究，結果表明改進的復合銀染法得到的膠片底色淺、條帶清晰、檢測靈敏度高、相關性好，是一種較好的染色方法。并使用這種方法對煙粉虱、溫室白粉虱成蟲的生理代謝進行了初步比較研究。

1材料與方法

1．1供試蟲源及寄主植物

煙粉虱室內繼代飼養，供試植物茄子由本實驗室種植。溫度為(27±1)℃，相對濕度(RH)為70％～80％，光周期為L∥D=14 h∥10 h。溫室白粉虱為田間苘麻種群。

1．2可溶性蛋白的制備及SDS-PAGE

取1頭粉虱成蟲置于PCR管中，用15 μL蒸餾水做裂解液，粉碎后4℃，12 OOO r／min離心15 min，取上清液作為蛋白質待測液。凝膠采用Tris-HCl緩沖體系，分離膠濃度為15％，pH=8.8；濃縮膠濃度為4％，pH=6.8；兩種凝膠均為過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)系統化學聚合而成。以0.05％的溴酚藍作為電泳前沿指示劑。分段控制電壓，開始電泳時電壓為120 V，當待測液進入分離膠后電壓改為200 V，待溴酚藍指示劑接近分離膠底部約1 cm時停止電泳?？捡R斯亮藍法測定單頭粉虱成蟲蛋白量，重復5頭，測定3次。

1．3不同染色方法的比較

電泳結束后，將同一塊膠縱剖成3塊，分別用以下方法進行染色：(1)考馬斯亮藍染色；(2)海波銀染法染色；(3)考馬斯亮藍染色后再用海波銀染法染色(復合銀染法)。其中，考馬斯亮藍染色法步驟為：取下膠片做好標記，在搖床上染色(染色液：0.25 g考馬斯亮藍G2₂₅₀，100 mL乙醇，25 mL乙酸，用蒸餾水定容至250 mL)約30 min?；厥杖緞?，用蒸餾水沖洗藍色膠片，再倒入200 mL脫色液(400 mL95％乙醇，100 mL乙酸，用蒸餾水定容至1 000 mL)脫色，如此脫色數次至蛋白帶顯現。

1．4單頭粉虱可溶性蛋白的圖譜比較

分別取單頭煙粉虱成蟲、溫室白粉虱成蟲可溶性蛋白進行SDS-PAGE，然后利用復合銀染法進行染色，并對染色后的圖譜進行比較。

2結果與分析

2．1不同染色方法效果比較

利用不同的方法對煙粉虱、溫室白粉虱可溶蛋白(分別3.811、6.276 μg)SDS-PAGE染色，結果見圖1。從電泳圖譜可以看出，用考馬斯亮藍染色得到的膠片條帶少，且不清晰，背景較深(圖1a)；用海波銀染法染色后得到的條帶比考馬斯亮藍染色得到的要多，但是底色仍然比較重，影響條帶的清晰度(圖1b)；用復合銀染法所得條帶多、底色輕、條帶清晰，效果最好(圖1c)。

2．2復合銀染法在兩種粉虱可溶性蛋白圖譜分析中的應用

利用SDS-PAGE技術對1頭煙粉虱、溫室白粉虱成蟲可溶性蛋白圖譜進行比較(圖2)。煙粉虱和溫室白粉虱在蛋白質遷移率(Rf)為0.355和0.383位置分別有一條明顯的特征性蛋白帶，可作為區分兩物種的依據。

3結論與討論

考馬斯亮藍染色法和銀染色法是蛋白質凝膠電泳兩種最主要的染色方法。考馬斯亮藍染色法靈敏度較低，銀染色法比考馬斯亮藍染色法的靈敏度約高出100倍，但在應用中顯色太快，穩定性和重復性較差。近年來，海波銀染法在昆蟲家蠅幼蟲蛋白電泳中不僅效果較好，而且簡便快速。本研究將該方法融入了傳統的復合銀染技術中，不僅具有傳統復合銀染技術的高靈敏度特點，而且具有簡單快速的特點。利用這種方法，1頭煙粉虱的1／2溶液(約1.900 μg)也可染出清晰圖譜。因此，本研究中的試驗方法，可能在小型昆蟲的蛋白電泳圖譜分析中具有較高的應用價值。