甘蔗花葉病抗病性鑒定接種新技術研究

李文鳳　黃應昆　盧文潔　羅志明

摘要：研究了甘蔗花葉病抗病性鑒定的一種新技術甘蔗生長期切莖接種法。此法和傳統苗期手指摩擦接種法相比，接種后發病率極顯著地高于手指摩擦接種法，且發病均勻、結果穩定，可以有效地區分不同甘蔗品種(材料)之間對病害的抗感性。比較11個甘蔗品種材料生長期切莖接種法和田間自然感病法對srMV-HH1的抗性鑒定，結果表明：兩種方法發病率呈正相關，且相關程度極密切，相關系數達0.999 7，鑒定所得的抗病性和抗病等級結果完全一致，說明切莖接種法鑒定結果能真實反映甘蔗品種材料的自然抗感性；此外該方法簡便實用、可操作性強、接種工效高，因此可以對大批量材料進行鑒定和篩選。

關鍵詞甘蔗花葉病；接種新技術；生長期切莖接種法

中圖分類號：S 435．661

甘蔗花葉病是一種重要的世界性甘蔗病害。近年來，該病在我國福建、廣東、廣西、四川和浙江等蔗區普遍發生，目前已成為云南蔗區發生最為普遍，危害最為嚴重的主要病害。全省年發病面積達6.67萬hm²以上，其中嚴重發病面積達3.3萬hm²以上，且有逐年擴展蔓延加重危害之趨勢。感病品種，發病嚴重田塊發病率高達100％。甘蔗感病后一般造成10％～40％的產量損失，糖分下降。其病原復雜，可由馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、高粱花葉病毒(Sbrghum mosaic virus，SrMV)、玉米矮花葉病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)、約翰遜草花葉病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)、玉米花葉病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)、甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)等6種病毒單獨或復合侵染引起。此病主要靠蚜蟲、帶病蔗種和蔗刀等收砍工具傳播。國內外大量的研究表明：對甘蔗花葉病最經濟有效的控制方法，就是選用抗病優良品種。因此對甘蔗種質資源進行抗性評價、篩選優良抗源以指導培育抗病品種成為育種學家和植病學家共同的重要目標。優良抗源的篩選工作必須以數量多、范圍廣的甘蔗種質資源抗性評價為基礎，因此急需研究建立一套快速簡便、致病性穩定、規范、實用的抗性鑒定技術。

目前甘蔗種質資源對花葉病的抗性鑒定方法有大田病圃鑒定、田間自然感病鑒定和人工接種鑒定。它們各具有優點和局限，大田病圃鑒定和田間自然感病鑒定是最為普遍、直觀的方法。但其鑒定周期長、占用土地面積大、鑒定材料數量有限；而且由于病圃和田間中的自然病原及種類分布不均勻、氣候和傳播媒介等環境條件變化常常會影響鑒定結果的真實性、穩定性和準確性。人工接種鑒定快速簡便、鑒定材料數量不受限制，且環境條件可人為控制，可以滿足大規模篩選抗源材料的需要。目前常用的人工接種方法有噴霧接種法、手指摩擦接種法。噴霧接種法主要用于大批量材料接種，手指摩擦接種法則用于小批量材料接種。但兩種方法都需要在接種時用手工搓揉蔗葉制造傷口，由于不易掌握搓揉力度，往往導致搓揉傷口不均勻，從而使接種后發病不均勻，致病性不穩定，影響鑒定結果。此外，由于甘蔗葉片表面布滿毛群，葉緣鋸齒尖利，人工摩擦(搓揉)易劃傷手，也給具體操作帶來困難，導致接種工效低。鑒于此，本研究在現有的、普遍采用的苗期接種技術基礎上，研究建立了甘蔗生長期切莖接種鑒定法，并與苗期手指摩擦接種鑒定法和田問自然感病鑒定法結果進行比較。

1材料與方法

1．1供試甘蔗品種材料

供試甘蔗品種從本所脫毒健康苗圃選擇粵糖79-177、臺糖134、川糖61-408、粵糖89-240、云蔗89-151、桂11、Co281、cp31-588、拔地拉、ROC10、ROC22等品種無病健壯蔗株，各品種蔗株分別切成雙芽苗，在流動冷水中浸泡48 h之后，用(50±0.5)℃熱水處理2～3 h，再用80％敵敵畏和50％多菌靈可濕性粉劑1：800液浸種5～10 min，然后分別種植在塑料桶內，置于防蟲溫室，常規栽培管理。

1．2接種病毒源及接種液準備

病毒源取自云南省農業科學院甘蔗研究所李文風等從甘蔗上分離鑒定的高粱花葉病毒強致病性分離物SrMV～HH1(另文發表)，繁殖保存在甘蔗品種云蔗89-151上。

接種前取幼嫩的病葉組織剪細后，加3倍量(V／W)濃度為0.1 mol／L，pH為7.2的磷酸緩沖液(含0.2％Na₂SO₄)，研磨成勻漿，雙層紗布過濾，濾液即為病毒接種液。

1．3鑒定方法

1．3．1手指摩擦接種法

選擇甘蔗苗期陰涼的傍晚進行接種。撒適量500～600目金剛砂于病毒接種液中，攪拌混勻，以拇指和食指尖沾濕接種液，緊捏供試甘蔗小苗基部，加壓輕輕搓揉至擦傷蔗葉表皮，重復接種3次，每次間隔7 d，每個品種接種20株。

發病率調查方法：首次接種7 d后，開始調查發病率，以后每隔15天調查1次，直至發病率穩定為止。調查記錄接種日期、接種苗數、病害癥狀始現期、累計發病叢數。

分級標準：參照文獻[6]的標準按1～5級分級進行抗性水平分類(表1)。

1．3．2切莖接種法

甘蔗生長期進行。用鋒利刀片或枝剪把甘蔗植株地上部分沿土表快速切去，再用滴管吸1滴病毒接種液滴入留下的地下蔗頭創面上，每品種接種20株，之后用報紙蓋住遮光24 h后揭開。

發病率調查方法：接種20 d后，開始調查發病率，以后每隔15天調查1次，直至發病率穩定為止。調查記錄接種日期、出苗數、病害癥狀始現期、累計發病叢數。

分級標準：同1．3．1。

1．3．3田間自然感病法

選擇本所甘蔗花葉病易于發生和傳播的田塊設置自然感病試驗觀察田。上述11個供試品種，每品種種植2行，行長5 m，為1小區。小區間種植1行病蔗(云蔗89-151)，作為病原，各小區隨機排列，重復3次。

發病率調查方法：種植50 d后，開始調查發病率，以后每隔30天調查1次，直至發病率穩定為止。調查記錄種植日期、出苗數、病害癥狀始現期、累計發病叢數。

分級標準：同1．3．1。

2結果與分析

2．1兩種接種方法接種效果比較

通過比較兩種接種方法甘蔗花葉病的接種效果，結果發現(表2)：11個供試材料中，除Co281兩種接種方法都未致其發病外，其余10個材料甘蔗生長期切莖接種法發病率均比手指摩擦法高，且發病顯著、發病均勻。以其發病株率作百分數顯著性t測驗，p＜0.01，表明切莖接種法的發病率極顯著地高于手指摩擦接種法。

2．2切莖接種法與田間自然感病法對SrMV-HH1抗性鑒定結果比較

比較11個甘蔗品種材料生長期切莖接種法和田問自然感病法對SrMV-HH1的抗性鑒定，結果發現(表3)：兩種方法發病率呈正相關，且相關程度極密切，相關系數達0.999 7；根據1．3．1的分級標準，11個材料兩種方法鑒定所得的抗病性和抗病等級結果完全一致，說明切莖接種法鑒定結果能真實反映甘蔗品種材料的自然抗感性，因而可以替代田間自然感病法鑒定。

3小結與討論

甘蔗抗花葉病鑒定是甘蔗抗病育種的一個關鍵環節，而室內人工接種鑒定甘蔗對花葉病的抗性是抗花葉病鑒定的一個重要組成部分，具有快速和鑒定材料數量不受限制，環境條件可人為控制，可以滿足大規模篩選抗源材料的優點。室內人工接種鑒定可大批量篩選抗源、使育種工作者及時了解掌握育種材料的抗感性，從而合理選配親本組合、選育出抗病優良品種供生產上推廣應用。由于目前常用的兩種室內人工接種方法(噴霧接種法、手指摩擦接種法)都需要在接種前用手工搓揉蔗葉制造傷口，因不易掌握搓揉力度，往往導致搓揉傷口不均勻，從而使接種后花葉病發病不均勻，致病性不穩定，影響鑒定結果；此外，甘蔗葉片表面布滿毛群，葉緣鋸齒尖利，人工摩擦(搓揉)易劃傷手，也給具體操作帶來困難。

本研究研制出的甘蔗仡葉病接種新技術－甘蔗生長期切莖接種法，通過和常用的接種技術比較，具有以下特點：(1)接種后甘蔗花葉病發病顯著、靈敏度高，可以有效區分不同甘蔗品種(寄主)之間對病害的抗感性；(2)運用切莖后在切口處點病毒液的接種方法，制造的傷口均勻，接種病毒量一致、接種后發病均勻、結果穩定性好；(3)由于帶毒收砍工具(蔗刀等)交叉感染是甘蔗花葉病傳播的主要途徑，而生長期切莖接種法與此種傳播方式很相似，因此鑒定結果更接近于田間自然感病結果；(4)生長期切莖接種法快速簡便，不用人工搓揉甘蔗葉片，不易劃傷手，因而可操作性強、接種工效高。因此可以對大批量材料進行鑒定和篩選，為育種和生產部門提供更多更廣泛的抗源材料。