枇杷花腐病病原物的初步鑒定

瞿付娟　竇彥霞　肖崇剛　董國(guó)菊

摘要：經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在重慶發(fā)生的枇杷花腐病癥狀有2種類(lèi)型：干腐型和濕腐型。通過(guò)病原菌形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和致病性測(cè)定，初步鑒定這兩種癥狀分別由擬盤(pán)多毛孢菌[Pestalotiopsis eriobotrifolia(Guba)Chen et Cao]和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)引起。枇杷花腐病害的發(fā)生與環(huán)境濕度有關(guān)，且濕度越大，病害發(fā)生越嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：枇杷；花腐病；病原鑒定；濕度

中圖分類(lèi)號(hào)：S 436．6

枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lind.]為薔薇科常綠喬木果樹(shù)，原產(chǎn)中國(guó)，栽種歷史悠久。近年來(lái)，枇杷在重慶的種植面積不斷增加，隨著生產(chǎn)規(guī)模日益擴(kuò)大，枇杷上相繼暴發(fā)各種病害，尤其是枇杷花腐病的發(fā)生，嚴(yán)重制約了枇杷的正常生產(chǎn)。據(jù)調(diào)查，花腐病帶來(lái)的后果是災(zāi)難性的，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)97.4％。引起枇杷花腐的病因，鄭少泉等認(rèn)為在花期或果實(shí)成熟期，枇杷灰霉病可發(fā)生，病原菌為Botrytis cinerea Pers；肖宇等認(rèn)為灰霉菌不是引起花穗腐爛的關(guān)鍵性致病病原菌，認(rèn)為是在花腐病的中后期腐生上去的；但到目前還沒(méi)有比較詳細(xì)的研究報(bào)道。為進(jìn)一步掌握枇杷花腐病害發(fā)生發(fā)展規(guī)律，明確引起病害發(fā)生的主要病原種類(lèi)，筆者在2004年9月至2006年12月對(duì)重慶枇杷進(jìn)行了全面的調(diào)查研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1．1枇杷花腐病標(biāo)本來(lái)源

2004年9月至2007年1月期間，在重慶九龍坡、合川、永川、壁山等6個(gè)大型枇杷生產(chǎn)基地，采用系統(tǒng)抽樣和隨機(jī)采集相結(jié)合的方法調(diào)查枇杷花腐病病害發(fā)生情況，并以大五星枇杷為例，在同一田間，每月隨機(jī)抽取大五星枇杷10株，調(diào)查枇杷花腐發(fā)病情況與當(dāng)?shù)乜諝鉂穸鹊年P(guān)系。其中當(dāng)?shù)乜諝獾臐穸扔筛蓾袂驕囟缺頊y(cè)得。

1．2 病原菌的分離

選取不同采集地新鮮且具典型癥狀的枇杷花腐病花枝，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)組織分離純化，分離的菌株經(jīng)單孢純化后保存于PDA斜面上，置4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1．3病原菌致病性測(cè)定

采用離體花枝接種法。在枇杷開(kāi)花季節(jié)，采集感病品種大五星的健康花枝，插于盛水三角瓶中，每日換水1次，用孢子懸浮液(5×10²個(gè)／mL)進(jìn)行噴霧離體接種，在25℃連續(xù)光照的條件下進(jìn)行保濕培養(yǎng)，以清水作為對(duì)照，共設(shè)置90枝枇杷花枝重復(fù)。保濕24 h后，觀(guān)察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病花朵進(jìn)行再分離，顯微鏡下觀(guān)察分離得到的病原菌是否與原接種菌株相同。

2結(jié)果與分析

2．1田間調(diào)查

200 4年9月至2007年1月期間，在枇杷花盛開(kāi)季節(jié)，共調(diào)查枇杷1 086株，其中株病花率達(dá)到50％的有519株，且不同品種花腐病發(fā)病程度不同。其中大五星及龍泉一號(hào)品種的枇杷花穗腐爛最多，在調(diào)查的246株大五星枇杷和213株龍泉一號(hào)枇杷發(fā)病率分別達(dá)到63.1％和62.7％，說(shuō)明大五星和龍泉一號(hào)為易感花腐病的品種；同一品種在不同濕度下發(fā)病程度也不同(圖1)。圖1是以大五星枇杷為例，用Excel軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪出的2004年9月至2007年1月期間枇杷花腐病每月發(fā)病率和月平均濕度圖。結(jié)果表明，凡雨季來(lái)臨早或雨量大或雨日多的年份，濕度大，發(fā)病早，傳播蔓延快，危害嚴(yán)重。特別是在2004年9～12月雨水特別多，濕度大，此時(shí)正值枇杷開(kāi)花之季，重病果園區(qū)發(fā)病率高達(dá)99.7％，形成有花無(wú)果，直接影響了枇杷的座果率；而2006年重慶干旱嚴(yán)重枇杷花腐發(fā)病率明顯降低。

2．2病害癥狀

在9月下旬，花腐病就開(kāi)始危害枇杷花蕾，調(diào)查發(fā)現(xiàn)花腐病癥狀有2種類(lèi)型。一種是干腐型：花軸表皮變褐，再沿花軸逐漸向整個(gè)花蕾擴(kuò)展，從花軸變褐部分至花朵皺縮干枯呈萎蔫狀，后脫落，在后期花朵脫落后，花軸和花朵基座上產(chǎn)生黑色小點(diǎn)(圖2a)，經(jīng)鏡檢黑色小點(diǎn)是分生孢子盤(pán)及分生孢子(圖2b)。另一種癥狀是濕腐型：花軸組織軟腐，呈粑爛狀，濕度大時(shí)，上面常有灰色霉?fàn)钗锍霈F(xiàn)。花蕾發(fā)病，病斑灰黑色，可阻止花開(kāi)放，病蕾變褐枯死，花受侵害時(shí)，部分花瓣變褐色皺縮腐爛。在溫暖潮濕的環(huán)境下，灰色霉層可以完全長(zhǎng)滿(mǎn)受侵染的部位(圖2c)。

2．3病原菌培養(yǎng)性狀

無(wú)論從新鮮的枇杷花腐病組織中分離純化，還是采用病花枝上孢子挑取進(jìn)行分離純化，結(jié)果一致，且都得到2種菌：記為PF-1和PF-2。現(xiàn)將其特征分別描述如下：

PF-1在PDA上培養(yǎng)時(shí)，菌絲體絨狀松軟，早期呈輪紋狀。培養(yǎng)8～10 d后，菌絲體上產(chǎn)生分生孢子盤(pán)，分布于整個(gè)菌落(圖3a)；分生孢子盤(pán)(圖3b)呈球形，直徑150～280 μm，頂端有墨汁狀黏液即產(chǎn)生的分生孢子；分生孢子成熟后直立或稍彎曲，廣梭形，長(zhǎng)17.9～24.8μm，寬6.4～8.1 μm，具5個(gè)細(xì)胞，長(zhǎng)22～26 μm，中間3個(gè)細(xì)胞有色，長(zhǎng)14～17 μm，分隔處不具顯著縊縮；頂部細(xì)胞短而無(wú)色，基部細(xì)胞較小；有鞭毛3根，有時(shí)僅有2根，長(zhǎng)16.8～30.1 μm；柄長(zhǎng)2.97～7.01 μm(圖3c)。PF-2在PDA平板上培養(yǎng)形成淡褐色菌落，氣生菌絲稀疏，易產(chǎn)孢，在PDA能形成菌核，直徑2.5～6.3 mm，單生，圓形至長(zhǎng)圓形(圖3d)。肉眼可見(jiàn)的灰棕色霉層就是該菌絲體和分生孢子梗及成堆的分生孢子，分乍孢子梗淡褐色不分支，可進(jìn)行1～5級(jí)的亞分支，和主軸呈變化較大的銳角，頂端明顯膨大，梗粗長(zhǎng)(圖3e)；分生孢子葡萄狀堆集在梗末端，單孢，卵圓或側(cè)圓形，末端稍突。無(wú)色至淡橄欖色，大小8～14 μm×6～9 μm(圖3f)。

2．4病原菌致病性測(cè)定

在接種病原菌PF-1的30枝枇杷花穗中，第3天出現(xiàn)花軸表皮變褐病癥的有23株，發(fā)病率達(dá)到76.7％，一旦花軸變褐，變褐部位擴(kuò)展速度很快，第4天，花朵皺縮干枯呈萎蔫狀，第6天，花朵脫落，第8天，變褐部位和脫落后的花朵基座上產(chǎn)生黑色小點(diǎn)。在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照均未發(fā)病。

在接種病原菌PF-2的30枝枇杷花穗中，第3天出現(xiàn)花軸表面腐爛病癥的有19株，發(fā)病率達(dá)76.7％，第4天花朵變褐，皺縮。第6天花朵腐爛，花軸至花朵長(zhǎng)滿(mǎn)灰色霉層。在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照均未發(fā)病。

無(wú)論病原菌PF-1還是病原菌PF-2的接種試驗(yàn)均表明，病斑同原分離菌所在病斑形態(tài)特征一致，且從接種菌產(chǎn)生的病斑再次保濕和在PDA培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)后顯微鏡觀(guān)察，其結(jié)果仍為原分離菌，因此證實(shí)了原接種菌株為致病菌。

2．5病原菌的鑒定

根據(jù)上述菌株的形態(tài)特征，結(jié)合致病性測(cè)定，并參照相關(guān)文獻(xiàn)，確定病原菌PF-1為擬盤(pán)多毛孢[Pestalotiopsis eriobotrifolia(Guba) chen et

Cao]；病原菌PF-2為灰葡萄孢(Botrytis cinereaPers.)。

3結(jié)論與討論

通過(guò)跟蹤調(diào)查重慶枇杷花腐病害的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)濕度越大，枇杷花腐病害發(fā)生越嚴(yán)重，從病理角度分析，病原物與寄主的接觸和侵入都和濕度及雨水等氣象條件有關(guān)，絕大部分靠氣流傳播的真菌，濕度越高對(duì)病原菌的侵入越有利。因此，盛花期的陰雨天氣是導(dǎo)致花腐病發(fā)生的重要環(huán)境因素。

擬盤(pán)多毛孢屬及相關(guān)屬是從盤(pán)多毛孢屬分離出來(lái)的。值得提出的是，擬盤(pán)多毛孢屬及其相鄰屬的分類(lèi)目前依然處于比較混亂的局面。傳統(tǒng)的擬盤(pán)多毛孢屬分類(lèi)多數(shù)以Guba的檢索表為依據(jù)，該檢索表包含了前人發(fā)表過(guò)的種，但種間特征模棱兩可，steyaert年建立了擬盤(pán)多毛孢屬(Pesta-lotiopsis]，他將原廣義盤(pán)多毛孢屬(Pestalotia)中分生孢子具5個(gè)細(xì)胞，中間3個(gè)細(xì)胞深色的種歸入Pestalotiopsis中。Sutton和Nag Raj先后對(duì)擬盤(pán)多毛孢屬的特征作不同的界定，兩個(gè)分類(lèi)系統(tǒng)矛盾的焦點(diǎn)在于對(duì)擬盤(pán)多毛孢屬和截盤(pán)多毛孢屬等屬的界定不同，韋繼光等通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)研究證明sutton界定的屬間特征是合理的。即擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsis)分生孢子具有5個(gè)細(xì)胞，頂端多根附屬絲，附屬絲不分支或非二叉分支；截盤(pán)多毛孢屬分生孢子4個(gè)細(xì)胞，具有多根頂端附屬絲。陳國(guó)貴等鑒定出引起枇杷葉片灰斑病的病原菌是盤(pán)多毛孢屬。按照其病原菌形態(tài)描述特征，陳家云認(rèn)為引起枇杷灰斑病的病原菌是擬盤(pán)多毛孢[Pestalotiopsiseriobotrifolia(Guba)Chen et Cao]。因此本試驗(yàn)參照上述鑒定標(biāo)準(zhǔn)及從分離的代表菌株的形態(tài)、培養(yǎng)性狀和致病性測(cè)定進(jìn)行綜合分析認(rèn)為，引起枇杷花腐病干腐癥狀的病原菌為擬盤(pán)多毛孢[Pestalotiopsis eriobotrifolia (Guba) chen etCao]。枇杷花腐病在我國(guó)的報(bào)道很少，陳福如等報(bào)道在花穗成熟期灰葡萄孢菌可侵染，而肖宇等僅僅報(bào)道枇杷花腐病可能是由擬盤(pán)多毛孢菌引起的，本文首次全面報(bào)道引起枇杷花腐病的病原菌為擬盤(pán)多毛孢(P.eriobotrifolia)和灰葡萄孢(B.cinerea)，為枇杷花腐病害防治打下了理論基礎(chǔ)。本文為該項(xiàng)研究的部分試驗(yàn)結(jié)果，今后將對(duì)該病的生物學(xué)特性和綜合防治作進(jìn)一步研究。