１５種植物源化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的活性比較

閆　磊　肖　婷　牛洪濤　于天叢　羅萬(wàn)春

摘要：利用離體生測(cè)方法，系統(tǒng)測(cè)定和比較了15種植物源化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的活性。結(jié)果表明，dl-薄荷醇和香茅醇等10種化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)具有較高的活性；選用6種高活性化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的毒力測(cè)定結(jié)果表明：處理24 h和48 h后6種化合物的LC₅₀由小到大的順序分別為：油酸＜間苯三酚＜間苯二酚＜檸檬酸＜dl-薄荷醇＜香茅醇；油酸＜間苯二酚＜香茅醇＜間苯三酚＜檸檬酸＜dl-薄荷醇。

關(guān)鍵詞：植物源化合物；馬鈴薯莖線蟲(chóng)；活性

中圖分類號(hào)：S 482．51

馬鈴薯莖線蟲(chóng)(Ditylenchus destructorThorne，1945)，是農(nóng)作物重要病原線蟲(chóng)，主要為害馬鈴薯塊莖和甘薯塊根，我國(guó)過(guò)去一直將其列為對(duì)外檢疫對(duì)象。除了馬鈴薯和甘薯外，它還能為害豌豆、花生等，但在我國(guó)主要為害甘薯，可引發(fā)甘薯莖線蟲(chóng)病。甘薯是山東、河北、河南等北方地區(qū)的重要作物。當(dāng)前甘薯生產(chǎn)亟待解決的突出問(wèn)題是防治分布廣泛的甘薯莖線蟲(chóng)病，又俗稱糠心病，受害甘薯一般減產(chǎn)20 ％～30％，嚴(yán)重的達(dá)70％～80％，甚至絕收，是甘薯上的一種毀滅性病害。

如今，甘薯莖線蟲(chóng)病的防治主要依賴化學(xué)防治，目前廣泛使用的藥劑主要有辛硫磷、克百威、苯線磷、甲基異柳磷、滅線磷、涕滅威等。而涕滅威憑借其防治成本低，防效及增產(chǎn)效果好的特點(diǎn)，被廣泛推廣使用。但這些應(yīng)用防治的藥劑以高毒和劇毒產(chǎn)品為主，對(duì)人畜極不安全，并且對(duì)環(huán)境造成了很大污染。而植物源殺線蟲(chóng)劑來(lái)源于自然界，在環(huán)境中易降解，對(duì)人類安全，具有良好的環(huán)境相容性，已越來(lái)越受到人們的重視。目前已報(bào)道的具有殺線蟲(chóng)活性的植物源化合物約有10多類100余種，表明在環(huán)境友好殺線蟲(chóng)劑的研究與開(kāi)發(fā)中該類化合物具有很大潛力。本文系統(tǒng)測(cè)定和比較了文獻(xiàn)已報(bào)道的具有殺線蟲(chóng)活性的15種植物源化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的活性，以加深對(duì)此類化合物的認(rèn)識(shí)并為其選擇性開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1供試化合物

15種供試植物源化合物見(jiàn)表1。

1．2供試線蟲(chóng)的分離培養(yǎng)

供試線蟲(chóng)為馬鈴薯莖線蟲(chóng)(Ditylenchus de-structor)，將采集到的病薯(甘薯)用自來(lái)水沖洗干凈，剖開(kāi)病薯，用刀切成薄片，然后用鑷子將病薯撕成小塊，在漏斗底部鋪上兩層餐巾紙，將切好的病薯小塊放人漏斗中加入無(wú)菌水，下面用帶止水夾的橡膠管相連，每隔12 h左右打開(kāi)止水夾用燒杯接取橡膠管中下部的液體備用。

將分離到的線蟲(chóng)用無(wú)菌水洗出，沖入無(wú)菌的指形管中，用0.5％的次氯酸鈉消毒2 min，然后用無(wú)菌水沖洗2～3遍，使線蟲(chóng)自然沉降或用離心機(jī)使線蟲(chóng)快速沉淀(6 000 r／min，3 min)。再在離心管中加入各約500 mg／kg的鏈霉素(100萬(wàn)單位／g)，保持1 h，離心后吸出消毒液。再用無(wú)菌水沖洗3遍，定容到一定體積放在4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在PDA(約20 mL)平板中接入灰葡萄孢(Botrytis ci-nerea Pers)，25℃溫箱中暗培養(yǎng)。待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿后，在培養(yǎng)基中央刻一小口，加入消毒過(guò)的馬鈴薯莖線蟲(chóng)約500條。將培養(yǎng)皿用封口膜(Para-film)包好，正置放入25℃溫箱中黑暗培養(yǎng)。接種培養(yǎng)2～3 d后將培養(yǎng)皿皿蓋朝下放置，繼續(xù)培養(yǎng)35～40 d，將培養(yǎng)皿皿蓋上的線蟲(chóng)用無(wú)菌水沖洗到燒杯中備用。

1．3室內(nèi)毒殺活性測(cè)定(藥液浸泡法)

參照萬(wàn)樹(shù)青使用的浸漬法進(jìn)行。將15種化合物用丙酮(溶于水的則用無(wú)菌水)配制成一定濃度的母液備用。將同樣體積(V₁)的線蟲(chóng)懸浮液注入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的樣品孔內(nèi)，再根據(jù)試驗(yàn)濃度[按式(1)計(jì)算]需要補(bǔ)充添加的無(wú)菌水(V₂)，最后加入相應(yīng)量的藥劑母液(V₃)，混合均勻后置于27℃培養(yǎng)箱中。每處理4次重復(fù)，每重復(fù)50～100條線蟲(chóng)。處理后24 h與48 h分別檢查各處理的線蟲(chóng)死亡／存活情況，按式(2)和式(3)分別計(jì)算線蟲(chóng)死亡率和校正死亡率。

式中：V=線蟲(chóng)懸浮液體積V₁+補(bǔ)充無(wú)菌水體積V₃+藥劑母液體積V₃，試驗(yàn)中N是事先設(shè)定的；為保證處理線蟲(chóng)數(shù)量的一致性，V₁也是固定的，如V₁=100 μL；No是已知的，那么將V固定，一般V=400 μL。據(jù)此可以得出不同處理的V₂、V₃。

2結(jié)果與分析

2．1供試化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的室內(nèi)(離體)活性測(cè)定結(jié)果

按1．3藥液浸泡法對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)進(jìn)行室內(nèi)生物活性測(cè)定(試驗(yàn)濃度為2 mg／mL)。試驗(yàn)中設(shè)空白對(duì)照(根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，當(dāng)丙酮與甲醇濃度低于20％時(shí)，對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)無(wú)顯著影響)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2結(jié)果可以看出：藥劑處理后24 h，dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸、間苯二酚、間苯三酚、槐胺堿、野靛堿、槐定堿和槐果堿這10種化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒殺活性，線蟲(chóng)的校正死亡率均達(dá)89％以上，其結(jié)果與其他各處理問(wèn)存在顯著性差異，其中dl-薄荷醇的校正死亡率最高，達(dá)99.78％；另外，具有中等殺線蟲(chóng)活性的處理為苦豆堿和苦參堿。

藥劑處理后48 h，各處理的防治效果有了一定的變化，dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸、間苯二酚、間苯三酚、槐胺堿和野靛堿這8種化合物仍對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒殺活性，線蟲(chóng)的校正死亡率均達(dá)89％以上，其結(jié)果與其他各處理間存在顯著性差異，其中DL-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸的校正死亡率最高，均達(dá)到了100.00％；而苦豆堿和槐定堿則表現(xiàn)出中等殺線蟲(chóng)活性。

通過(guò)圖1比較15種化合物處理后24 h與48 h的校正死亡率，可以發(fā)現(xiàn)槐定堿、槐胺堿、槐果堿48 h的校正死亡率反而低于其24 h的結(jié)果；其原因可能是此3種化合物在處理后24 h對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)表現(xiàn)出一定的擊倒作用，但線蟲(chóng)并沒(méi)有被真正殺死，只是暫時(shí)被擊倒麻痹，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后又出現(xiàn)復(fù)蘇現(xiàn)象。

2．2供試化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的毒力比較

為了進(jìn)一步對(duì)供試化合物進(jìn)行活性篩選和比較，根據(jù)表2的結(jié)果選定了dl-薄荷醇、香茅醇、油酸、檸檬酸、間苯二酚、間苯三酚進(jìn)行系統(tǒng)毒力測(cè)定。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，將供試化合物配制為5個(gè)濃度，則6種化合物對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)的毒力結(jié)果如表3所示。

由表3的結(jié)果不難看出，處理24 h后6種化合物的LC₅₀由小到大的順序?yàn)椋合忝┐迹糳l-薄荷醇＜檸檬酸＜間苯二酚＜間苯三酚＜油酸；處理48 h后6種化合物的LC₅₀由小到大的順序?yàn)椋篸l-薄荷醇＜檸檬酸＜間苯三酚＜香茅醇＜間苯二酚＜油酸。

3討論

本文測(cè)定的4類15種植物源化合物多數(shù)已經(jīng)被報(bào)道具有殺線蟲(chóng)活性，其中香茅醇和dl-薄荷醇對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有較好的活性，且從本試驗(yàn)結(jié)果看，它們對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)也表現(xiàn)出較高的毒殺活性。對(duì)本試驗(yàn)中采用的鄰苯二酚、對(duì)苯二酚及間苯三酚，文獻(xiàn)僅報(bào)道可以抑制腎形小盤(pán)旋線蟲(chóng)(Rotylenchulusreniformis)對(duì)番茄的侵染，而苦豆堿、苦參堿、槐胺堿及野靛堿可以殺死松材線蟲(chóng)，本試驗(yàn)結(jié)果豐富了前人的研究?jī)?nèi)容，證明了上述化合物同樣對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)具有一定的毒殺活性。另外，有報(bào)道用毒扁豆堿1 000 μg／mL可以可逆性地抑制起絨草莖線蟲(chóng)(Ditylenchus dipsaci)的運(yùn)動(dòng)，但本試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)基本無(wú)效。有機(jī)酸類化合物檸檬酸和油酸對(duì)馬鈴薯莖線蟲(chóng)也具有較好的活性，這個(gè)結(jié)果提示，在殺線蟲(chóng)劑選擇性開(kāi)發(fā)中是應(yīng)該予以考慮的。

對(duì)本試驗(yàn)中所得到的6種化合物的毒力方程進(jìn)一步分析，可以看出毒力較好的香茅醇和dl-薄荷醇的6值有一定的差異，其中b值較低的dl-薄荷醇相比香茅醇而言可能就具有較高的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，而明確這一點(diǎn)對(duì)于該類化合物的更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)具有深層次的意義。

植物源殺線蟲(chóng)劑來(lái)源于自然界，具有很好的環(huán)境相容性，因而是環(huán)境友好殺線蟲(chóng)劑研究開(kāi)發(fā)的重要途徑；自然界具有豐富的植物資源，應(yīng)該深入開(kāi)展殺線蟲(chóng)植物資源的調(diào)查，有效地從備選植物中分離、提純殺線蟲(chóng)化合物并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)；同時(shí)，對(duì)已經(jīng)報(bào)道的高活性植物源殺線蟲(chóng)化合物進(jìn)行活性一結(jié)構(gòu)相關(guān)性研究，明確其作用機(jī)理，開(kāi)展仿生合成，應(yīng)成為開(kāi)發(fā)高效、環(huán)保型的殺線蟲(chóng)劑的重要思路。