抗感枯萎病黃瓜品種的病理組織結構學研究

馬艷玲　吳鳳芝　劉守偉

摘要：選取不同抗性黃瓜品種中農13(抗)和中農6號(感)為試材，采用蘸根法接種，利用電鏡技術和石蠟切片方法觀察了病菌侵染前后根莖組織結構的變化。結果表明，抗病品種有環紋和網紋兩種導管類型，有較厚的角質層，感病品種有環紋導管一種類型，無角質層?？共∑贩N在接種后細胞壁加厚、導管腔內出現褐色物、胞壁覆蓋物以及侵填體。感病品種僅出現胞壁加厚和胼胝體。對于病原菌侵染，抗感品種具有不同程度的反應，抗病品種反應程度早于且強于感病品種。

關鍵詞：黃瓜；枯萎病菌；組織病理學

中圖分類號：S 432．23

枯萎病屬于維管束病害，是影響黃瓜生長的主要土傳病害之一。常年發病率10％～30％，重病年份可達80％～90％，其病原菌為半知菌亞門鐮孢屬的尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusarium oxysporum f.sp.cu-cumerinum Owen)，我國流行的菌系為生理小種4號，引起這類病害的鐮孢屬真菌是土壤習居菌，病菌孢子的芽管或菌絲體由根毛侵入或通過根部傷口侵染植物。由一個孢子的一次侵染就足以引入病原物到植物內部。寄主植物的抗病性分為組織結構抗性和生理生化抗性兩個方面，組織結構抗病性是利用組織和結構的特點阻止病原物的接觸、侵入和擴展。本試驗對不同抗性黃瓜品種接種枯萎病菌，目的是探討寄主植物在組織結構方面的抗性機制。

1材料與方法

1．1供試材料

供試黃瓜品種為中農13(抗病)和中農6號(感病)，種子由哈爾濱市農科所提供。

1．2供試菌種

尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporumf.sp．cucumerinum)分離于東北農業大學試驗實習基地溫室內的黃瓜枯萎病病株。病原菌的分離、純化、培養及孢子懸浮液的制備參照王拱辰等、方中達的方法。

1．3試驗方法

供試品種種子經表面消毒后，播于滅菌的沙箱中，出苗后按日本山崎配方施營養液。成分為Ca(NO₃)₂·4H₂O826 mg／L，KNO₃607 mg／L，NH₄H₂PO₄115 mg／L，MgSO₄·7H₂O483 mg／L，微量元素為：NaFe-EDTA 20～40 mg／L，H₃BO₃2.86 mg／L，MnSO₄·7H₂O 2.13 mg／L，ZnSO₄·7H₂O0.22 mg／L，CuSO₄·5H₂O 0.08 mg／L，(NH₄)₆Mo₇P₂₄·4H₂Omg／L。待幼苗長至3～4片真葉時清水洗凈根部沙粒，再用蒸餾水沖洗2次后，在1×10⁷個／mL的孢子懸浮液中浸根30 min，浸沒深度1 cm左右。之后取出放入上述營養液中水培。定期切取根莖部觀察。

將切取的1mm大小的材料放入4%戊二醛中進行前固定，pH7.2磷酸緩沖溶液沖洗，1％鋨酸后固定，梯度乙醇一丙醇脫水，Epon-812環氧樹脂包埋，超薄切片機切片，雙重染色后，在透射電鏡下觀察細胞結構的變化以及病原真菌的侵染狀況。

石蠟切片制樣采用蕃紅固綠雙重染色法，參照李桂琴的方法。

2結果與分析

2．1枯萎病菌對抗病黃瓜品種的侵染過程及病理組織學變化

圖1是抗病品種枯萎病菌侵染過程及病理組織學變化，結果顯示：接種后16 h，抗病品種根莖部的角質層表面附著大量有隔或無隔的分生孢子(圖1a)，由于角質層較厚，開始萌發的孢子長出的菌絲體因難以有充足的營養提供而部分死亡。而入侵到表皮細胞的菌絲體在細胞間隙內生長，附近細胞出現質壁分離(圖1b)，薄壁細胞有細胞壁加厚現象(圖1c)，細胞內容物豐富(圖1d)，線粒體清晰(圖1e)。接種后40 h，發現通過皮層薄壁細胞的菌絲產生的孢子(圖1f)，以及薄壁細胞連接處的孢子(圖1g)，同時觀察到細胞壁增厚及斷裂現象(圖1h)。第64 h，在導管附近出現少量菌絲及其孢子(圖li)，而同時導管腔出現大量褐色物(圖1j)，并且發現有的導管壁分泌一層覆蓋物(圖lk)，而周圍并無菌絲。88 h后，導管內產生一個侵填體(圖1e)。

2．2枯萎病菌對感病黃瓜品種的侵染過程及病理組織學變化

圖2是感病品種枯萎病菌侵染過程及病理組織學變化，結果顯示：在接種后16 h，根莖部表皮細胞由于無角質層的覆蓋而被萌發的孢子降解(圖2a)。內皮層薄壁細胞內線粒體、高爾基體等細胞器發育良好，清晰可見(圖2b、c)。接種后40 h，皮層薄壁細胞細胞壁溶解，內有大量孢子(圖2d)，線粒體外膜部分斷裂，脊模糊不清(圖2e、f)，細胞間隙有大量菌絲，同時胞壁變厚(圖2g)。第64 h(圖2h、i)，細胞變形，內容物溶解(圖2h)，在胞壁斷裂處有小孢子出現(圖2i)。第88 h，篩管內的菌絲在向前生長時遇到胼胝體(圖2j)。

2．3抗感枯萎病黃瓜品種根莖導管類型的差異

圖3是抗感黃瓜品種根莖導管類型差異，結果顯示：抗病品種的導管類型有兩種，即環紋導管和網紋導管(圖3a、b)；感病品種僅有環紋導管一種類型(圖3c、d)。

3討論

史金瑞、苗琛等在西瓜枯萎病的細胞學研究中發現，抗病品種比感病品種具有較厚的角質層，本試驗結果與此相類似。程玉瑾等在研究西瓜枯萎病時沒有發現抗感品種西瓜根部存在結構差異。徐建華等對黃瓜枯萎病的研究中發現抗病品種較感病品種的壁覆蓋物厚、抗病品種中侵填體有細胞核，感病品種中侵填體發育不充分。Mace等認為壁覆蓋物、侵填體、褐色物等這些保衛反應的產生限制了菌絲擴展，對菌絲的入侵具有一定的阻礙作用。陳珉等認為感病品種的螺紋導管較多，而抗病品種以網紋導管為豐。本試驗結果表明，選取的兩個黃瓜品種存在結構上的差異，抗病品種有角質層，有環紋和網紋兩種導管類型；感病品種無角質層，有環紋導管一種類型?？共∑贩N受到病菌侵染后，較早的產生細胞壁增厚，褐色物，侵填體等，感病品種僅產生胞壁加厚和胼胝體。由于本試驗僅選取2個品種，試驗結果的普遍性有待于對更多的材料進行研究才能確認。