廣東省辣椒疫霉菌嘧菌酯的敏感性

姜彥全　王振中

摘要：從廣東省各地采集了54個辣椒疫霉菌株，分別測定了菌絲生長和游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性。結果表明，嘧菌酯對辣椒疫霉的菌絲生長具有很強的抑制作用，EC₅₀范圍為0.142 8～1.950 9 μg／mL，平均為0.964 9 μg／mL；對游動孢子囊形成的抑制作用更強，EC₅₀范圍為0.001 0～0.084 4 μg／mL平均為0.023 9 μg／mL。正態分析表明，辣椒疫病菌54個菌株菌絲生長對嘧菌酯的敏感性符合正態分布，而孢子萌發則在高濃度區具有拖尾現象，表明自然界中已存在個別具有一定耐藥性的辣椒疫霉種群。

關鍵詞：辣椒疫霉；嘧菌酯；抗藥性

中圖分類號：S，182．2

辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytohpthora capsici)引起的一種毀滅性土傳病害。在世界各地的辣椒種植區普遍發生，我國各辣椒產區疫病大量發生，嚴重影響了辣椒的產量和品質。辣椒疫霉除了侵染辣椒以外，還可以侵染番茄、茄子、黃瓜、甜瓜、西瓜、南瓜等，病菌侵染后潛育期短，發病快，因而辣椒疫病防治十分困難。目前，防治辣椒疫病主要用化學防治方法，由于辣椒疫霉菌極易對殺菌劑產生抗藥性，化學防治的效果常常因為病菌抗藥性的提高而大大降低。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(strobilurins)是以天然產物strobilurin A為先導化合物開發而來的一類仿生合成殺菌劑，是繼苯并咪唑類后的一類新穎殺菌劑。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一種廣譜殺菌劑，能有效地防治卵菌、接合菌、子囊菌、擔子菌和半知菌等真菌引起的病害。1992年11月第一個甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑新產品嘧菌酯(azoxystrobin)誕生，至2001年已在70個國家80多種作物上登記。嘧菌酯于2001年在我國登記，至今，strobilurins作為殺菌劑專利共有近30家公司，產品近500個。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用于真菌線粒體電子傳遞鏈的復合物Ⅲ，阻斷電子傳遞，干擾能量合成。由于其作用機制新穎，與苯基酰胺類殺菌劑無交互抗藥性，目前被廣泛使用。但已有研究表明某些病原菌靶標對該類藥劑產生抗藥性自發突變頻率較高。目前甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑剛開始應用于辣椒疫霉菌的防治，分析研究其抗藥性現狀和抗藥性產生的可能性，具有重要的實踐意義。

1材料與方法

1．1病原菌的分離與純化

在無菌操作條件下，將辣椒感病組織，切成0.5 cm見方的小塊，用75％的乙醇對上述小塊病組織表面消毒后，用已滅好菌的濾紙、保濕紙和硬紙依次由內到外包好，然后放在d=9 cm鋪有濾紙和保濕紙的培養肌中，每皿放3塊，在25℃下培養7～15 d，其中每隔3天觀察1次并保持病組織塊的濕潤狀態。選取白色霉狀物的病組織塊，再按照常規方法用次氯酸鈉溶液滅菌1 min后，放于選擇性培養基上進行培養。

按鄭小波的方法，將盛有大量孢子囊的培養皿放入4℃冰箱中10～15 min后，取出置于25℃下30 min，低倍鏡下可見大量游動孢子釋放．用滅菌吸管吸取孢子懸浮液1～4滴(視孢子濃度而定)涂布于含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的10％V8汁水瓊脂平板上，置25℃黑暗培養8～12 h。取出培養皿置于顯微鏡下觀察；切取帶有單個已萌發游動孢子的瓊脂塊置于選擇性培養基(含青霉素、利福平、五氯硝基苯各50 μg／mL的LBA培養基(利馬豆60 g加水1 000 mL，充分煮沸，4層紗布過濾去渣，濾液補足水至1 000 mL，加入瓊脂20 g)平板上，在25℃黑暗中培養2～3 d，可獲得純凈的單游動孢子無性系。

1．2辣椒疫霉菌絲生長對嘧菌酯的敏感性測定

本試驗所用的嘧菌酯由先正達公司贈送，為98％原藥。原藥先用V(甲醇)：V(丙酮)=1：3配制成濃度為100 μg／mL的母液備用。

將疫霉菌接種于LBA培養基平板上，25℃下黑暗培養5 d，用直徑4 mm的打孔器在近菌落邊緣1／3處打孔，制成接種菌絲圓碟。取適量的嘧菌酯母液，加入溶化后冷卻到50℃左右的LBA培養基中，混勻，制成0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL梯度濃度的LBA平板。待培養基冷卻后用接種針挑取菌碟，菌面向下接于含毒培養基中心，每皿1塊。放入恒溫箱中，25℃下培養5 d用十字交叉法測量菌落直徑，每處理4皿，試驗重復3次。

測量菌落直徑，依下式計算不同濃度藥劑對疫霉菌菌絲生長抑制率：

計算抑制率幾率值和濃度對數值的毒力方程，毒力公式計算嘧菌酯對疫霉菌各菌株的抑制中濃度EC₅₀及相關系數r值。數值統計計算用SAS程序進行。

對54個菌株的EC₅₀進行正態分布檢驗，確定是否符合正態分布。正態分布檢驗用SAS程序進行。

1．3辣椒疫霉游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性測定

參照Matheron等的方法，從生長在LBA平板上的疫霉菌落邊緣1／3處打直徑為5 mm的菌碟4塊，置于直徑為9 cm的培養皿中，加入含有0、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 μg／mL嘧菌酯的無菌水5 mL，使得液面剛剛沒過菌絲塊，24℃下光暗交替(12 h∥12 h)培養3 d后，倒去無菌水，在菌碟上滴加少許酸性品紅，10～15 s后滴加乳酸直至洗去大量品紅。游動孢子囊呈現紅色，在菌碟上隨機挑取3個視野，在顯微鏡下對游動孢子囊進行計數，每處理4皿，試驗重復3次。

同菌絲生長抑制試驗，計算54個菌株的EC₅₀，并進行正態分布檢驗。

2結果與分析

2．1辣椒疫霉菌的分離

從廣東省廣州番禺、韶關始興、陽江陽西、湛江雷州、茂名信宜以及惠州博羅等辣椒疫霉病經常發生的地區采集的辣椒疫病樣本，經分離、純化和鑒定后，確認得到了54個辣椒疫霉菌菌株(表1)。

2．2辣椒疫霉菌對嘧菌酯的敏感性水平測定

2．2．1辣椒疫霉病菌菌絲生長對嘧菌酯的敏感性

對單孢分離得到的54個單孢菌株，采用菌絲生長速率法測定各菌株的EC₅₀(表1)。

54個辣椒疫霉病菌菌株對嘧菌酯敏感性測定的結果表明，病菌群體對嘧菌酯敏感性表現沒有太大差異，如EC₅₀最高為湛江雷州的LZ9，EC₅₀為1.950 9 μg／mL，而惠州的HZl菌株EC₅₀最低，只有0.142 8 μg／mL，供試54個菌株的平均EC₅₀。為0.964 9 μg／mL。

在疫霉菌對藥劑的敏感性變化范圍內，將EC₅₀

等分為16個階段，統計每個階段菌株的個數和頻率，然后以每個階段EC₅₀的中值為橫坐標，頻率為縱坐標，作出頻率分布圖(圖1)，圖中的峰代表病原菌群體對藥劑的敏感性分布；同時，采用sPsS敏感性分布進行了K-S正態性檢驗，得Z=0.711 4，P=0.692 0，EC₅₀表現連續性，則說明這54個菌株對嘧菌酯不同敏感性菌株的頻率分布符合正態分布，辣椒疫霉自然種群對嘧菌酯沒有明顯的抗藥性。

因此對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑而言，病菌群體基本還處于原始種群，故此試驗測定得到的54個菌株對嘧菌酯的平均EC₅₀0.964 9 μg／mL，可作為辣椒疫霉菌對嘧菌酯的敏感性基線。

2．2．2辣椒疫霉病菌游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性

嘧菌酯對54個辣椒疫霉病菌游動孢子囊形成的EC₅₀為0.001 0～0.084 4 μg／mL(表2)，平均EC₅₀為0.023 9 μg／mL。嘧菌酯濃度為0.05 μg／mL時，對敏感菌株孢子囊形成的抑制率達89.4％，說明嘧菌酯對辣椒疫霉游動孢子囊形成有強烈的抑制作用，比對疫霉菌菌絲的活性高40.4倍。

采用SPSS敏感性分布進行了K-s正態性檢驗，得z=1.671，p=0.007 5，游動孢子囊對嘧菌酯的敏感性沒有呈現正態分布的規律(圖2)，部分菌株EC₅₀頻率分布有拖尾現象。這表明，在自然種群中，有部分自發突變的菌株有一定的耐藥性。

3結論與討論

在廣東省不同地區采集分離了54個辣椒疫霉病菌菌株，對這54個菌株進行嘧菌酯的敏感性測定表明，廣東省辣椒疫病菌的菌絲生長和孢子囊形成對嘧菌酯均具有較高的敏感性。54個菌株菌絲生長的敏感性符合正態分布，菌株間的EC₅₀分布連續，但部分菌株孢子囊形成對嘧菌酯有一定程度的耐藥性，EC₅₀具有拖尾現象。

辣椒疫病在發病初期田間易形成發病中心，病部在高濕條件下可形成大量游動孢子囊，并釋放游動孢子。游動孢子囊和游動孢子均可成為再侵染源，侵染健康植株。試驗結果表明，嘧菌酯對辣椒疫霉菌絲生長的抑制效果低于其對游動孢子囊的抑制效果。因此，在發病初期使用較低濃度的嘧菌酯可有效地抑制發病中心游動孢子囊的形成，從而對游動孢子囊及游動孢子的萌發起抑制作用，可以有效地抑制病原菌的再侵染，對病害的傳播和流行起到很好的控制作用。以有效中濃度(EC₅₀)為參數，嘧菌酯抑制菌絲生長的活性比抑制孢子囊形成要低25.3倍，說明了嘧菌酯對菌絲生長的抑制活性較低，對已發病的寄主治療效果較差。建議在防治辣椒疫病時應在發病初期，病原菌剛侵入寄主之時施藥。對辣椒疫霉病的防治宜采取嘧菌酯與多位點保護性殺菌劑混用或輪用的措施，以緩解內吸性殺菌劑對抗藥性的選擇壓力，延長藥劑的使用壽命。

當某一殺菌劑使用之前，病原群體中就有極少數菌株對此殺菌劑表現抗性，只是頻率很小。產生抗性的原因可能是：對單一作用位點的殺菌劑，病原菌只要發生單基因或少數寡基因的突變就可以導致病原物靶點結構的改變，而降低對專化性藥劑的親和性，某些生理生化代謝也可以發生某種變化，修飾細胞壁結構或生物膜的結構，阻止藥劑到達作用靶標，或者減少對藥劑的吸收，或者增加排泄，減少藥劑在細胞內的積累等而表現抗藥性。在測定辣椒疫霉菌游動孢子囊形成對嘧菌酯的敏感性時，發現EC₅₀頻率分布沒有呈現正態分布，而是有拖尾現象，可能主要是由菌株本身具有較低的抗性的結果。因為就疫霉菌本身來說，它是易產生突變的物種。