煙蚜繭蜂畸形細胞發(fā)生及發(fā)育

劉金文　李建平　叢　　斌　李茂海　楊桂華　侯云龍　曲文莉

摘要：煙蚜繭蜂(Aphidius gifuensis)畸形細胞來源于卵的漿膜層。蜂產(chǎn)卵33～36 h后幼蟲孵化，每胚胎平均釋放150個細胞。畸形細胞的直徑隨寄生日齡而增加，由初始直徑(22.1±6.5)pm增長到第5天達最大為(30.1±8.5)μm。但是，其大小受多種因素影響，隨寄主齡期和外界因素等不同而有差異，即使是條件相同其大小也有不同，最小的9.0 pm，最大可達100.0μm，但其數(shù)目卻隨日齡增長而下降。掃描電鏡顯示：畸形細胞表面覆有微絨毛，4日齡比1日齡的更長、更密，表明吸收和分泌功能增強。

關鍵詞：煙蚜繭蜂；畸形細胞；發(fā)生；發(fā)育；超微結構

中圖分類號：S 476．3

煙蚜繭蜂(Aphidius gifuensis)是寄生蔬菜、果樹、棉花和大田作物上蚜蟲的一種寄生蜂。作為一種害蟲生物防治的重要因子，在溫室以及大田中，煙蚜繭蜂都起到了很重要的作用。同時，畸形細胞對寄生蜂寄生寄主也起到了重要的調(diào)控作用。以煙蚜繭蜂和煙蚜作為一對模式體系能夠揭示寄生蜂寄生寄主的內(nèi)部機理，并對指導寄生蜂的人工飼養(yǎng)和利用、害蟲綜合治理以及探索應用生物高科技控制害蟲等方面均具有重要的理論和實踐價值。同時，為探索寄生蜂與寄主的協(xié)同進化作進一步的研究。

繭蜂科、廣腹細蜂科、緣腹卵蜂科的蜂卯孵化時，起胚胎營養(yǎng)作用的漿膜釋放到寄主血淋巴中，分散后游離形成畸形細胞。分散的畸形細胞在寄主血腔中發(fā)育方式從數(shù)量、大小、染色體倍性等變化呈現(xiàn)種的特異性。

本文以煙蚜繭蜂和煙蚜為研究體系，觀察了煙蚜繭蜂畸形細胞的發(fā)生和發(fā)育過程以及結構上的變化，這些研究為今后進一步探討其生理功能奠定基礎。

1材料與方法

1．1寄主植物

從沈陽農(nóng)業(yè)大學國家重點免疫實驗室試驗田中選擇直徑6～7 cm的蘿卜(Raphanus sativus L.)收藏備用。試驗前，將蘿卜栽植于塑料(d=14 cm)花盆內(nèi)，待新葉長至6～7 cm時放置于溫度為(25±2)℃，相對濕度為70％～90％，每日光照周期L∥D為14 h∥10 h，光照強度為3 000 lx的人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1．2供試昆蟲

1．2．1煙蚜

煙蚜(Myzus persicae)采自沈陽農(nóng)業(yè)大學植物病毒研究室試驗田的煙草上，然后接種到上述栽植的蘿卜葉片上，控制每株上的蚜量，連代擴繁保種，以備試驗。

1．2．2煙蚜繭蜂

從病毒研究室試驗田內(nèi)采集自然發(fā)生的僵蚜，在室內(nèi)羽化出蜂，經(jīng)鑒定確認后，按雌雄蜂1：1配對，交配后接種于預先繁殖有200～300頭煙蚜的盆栽蘿卜植株上，進行擴繁。

1．3煙蚜繭蜂畸形細胞在煙蚜體內(nèi)的發(fā)育

1．3．1畸形細胞測量

取150頭3～4齡若蚜，后分別轉移150個小型指形管(d=1.0 cm，h=2.5 cm)中，再接入150頭交配的雌蜂，觀察一次產(chǎn)卵寄生行為發(fā)生后，將被寄生的蚜蟲全部取出，放到新鮮無蚜蘿卜上繼續(xù)進行喂飼；從被寄生24 h后開始，至幼蜂完成在寄主體內(nèi)的發(fā)育，每隔24 h取下20頭蚜蟲，經(jīng)電光源解剖鏡(OLYMPUs JM型)，在滴有Ringers生理鹽水的載玻片上解剖，對不能及時解剖的蚜蟲用FAA液(冰醋酸：甲醛：95％酒精：水分別為1：1：10：7)固定。在每頭寄主的血淋巴中隨機測量20個畸形細胞的直徑，最后取其平均值。并對不同日齡畸形細胞，用倒置相差電光源顯微鏡(OBH型)拍照。畸形細胞活性由0.1％的中性紅吸收檢測。

1．3．2畸形細胞計數(shù)

在蜂卵孵化前，每隔24 h取出寄主蚜蟲20頭，在15×解剖鏡下，從寄主血淋巴中收集15粒卵，接種到含有TC-100Medium(GIBCO公司)的培養(yǎng)皿中，幼蜂孵化后，將其置于震動臺上，低速離心使畸形細胞從卵殼中完全游離出來，在顯微鏡下計數(shù)并計算每粒卵產(chǎn)生的畸形細胞的平均數(shù)。然后每隔24 h解剖被寄生的蚜蟲，取20頭幼蜂先浸于70％乙醇中，接著用蒸餾水沖洗，并將蜂表面水吸干，每頭幼蜂放在盛有TC-100 Medium的培養(yǎng)皿中解剖，去除寄主血細胞和其他雜物，用玻璃吸管收集其中的畸形細胞滴入離心管管中，3 000 r／min(TL-18M型)離心10 min，以1 mL PTU-PBS(8％苯基硫脲溶于磷酸鹽緩沖液0.067 mol／L PBS，pH7.0)沖洗3次，最終在10 mL PBS(0.067mol／LPBS，pH7.0)中懸浮，每10 mL樣品中抽取100 μL，用血細胞計數(shù)板觀察計數(shù)的畸形細胞的數(shù)量，取5次重復的均值再擴大100倍，即為總的畸形細胞數(shù)。

1．4煙蚜繭蜂幼蟲在寄主體內(nèi)的發(fā)育

從蜂卵產(chǎn)到寄主體內(nèi)24 h后，再每隔24 h解剖蚜蟲35頭，測量35頭幼蜂體長、體寬，根據(jù)計算公式V=n／4·LD²／4(V：體積；L：長度；D：寬度)計算卵、蛹、幼蟲及幼蜂的體積。

1．5畸形細胞超微形態(tài)結構的觀察

將按1．3．2中的方法收集并粗提的畸形細胞以2.5％戊二醛固定12 h，經(jīng)O．1 m01／I．PBS沖洗后，以4％鋨酸固定，乙醇梯度脫水，經(jīng)臨界點干燥、噴金后，用掃描電鏡(SEM)觀察。2結果與分析

2．1煙蚜繭蜂在寄主體內(nèi)的發(fā)育

煙蚜繭蜂雌蟲體內(nèi)發(fā)育成熟的卵為卵形或梨形，通常可見分隔(圖3)，卵長(75.0±5.0)μm，卵寬(25.0±5.1)μm；蜂卵在通過雌蜂產(chǎn)卵器時受到機械擠壓，蜂卵的中部稍稍凸起，一般呈檸檬形或長梭形，初產(chǎn)卵長(80.3±5.0)μm，寬(27.4±2.3)μm，卵期一般數(shù)小時至幾天；卵在發(fā)育過程中體積迅速增大，到幼蟲即將孵化時卵長(437.0±26.9)μm，寬(242.3±8.0)μm；當卵孵化后，進入幼蟲發(fā)育期和蛹期，從1齡幼蟲的體長(520.0±62.7)μm，體寬(252.9±9.7)μm迅速增長到4齡幼蟲的體長(2 300.2±129.1)μm，體寬(700.3±20.4)μm，此時的發(fā)育主要應用卵黃內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)。

2．2畸形細胞的產(chǎn)生

煙蚜繭蜂蜂卵從初產(chǎn)到幼蜂孵化，通過胚胎外透明的漿膜能清晰看到，用蕃紅染色呈淡綠色(而蚜蟲組織經(jīng)染色后呈現(xiàn)紅色)，通常在卵的前極漿膜先分化成畸形細胞，隨后其后極漿膜也形成畸形細胞。當幼蜂即將孵化時，隨著胚胎的扭動，可見卵的前后極已有球形的游離狀細胞在卯殼內(nèi)滾動，產(chǎn)卵后33～3 6 h，幼蜂孵化時，卵殼和漿膜層常常從卵的中上部一側破裂，隨幼蜂的脫出，有部分畸形細胞以單個或細胞團的形式釋放到寄辛血淋巴中，仍有部分細胞暫時停留在卵殼中，隨后才分散

到寄主血腔中。而中間的單層漿膜則繼續(xù)貼附在初孵的1齡幼蜂體上，孵化后數(shù)小時以細胞狀從幼蜂體脫落(圖4)。本研究與Dahlman等報道的結果相吻合。

2．3畸形細胞的發(fā)育

通常情況下，畸形細胞呈球形或橢圓形，釋放到寄主血淋巴中的顏色為白色或淡綠色，這與寄主血細胞的淡黃色相區(qū)別，隨著時間的延長，其體積迅速增加，由初始的直徑(22.1±6.5)μm至寄生后第5天達最大為(30.1±8.5)μm(圖1)。但是，其大小受著多種因素的影響，隨著寄主的齡期和外界因素等不同而有差異，即使是相同條件相同齡期其大小也有不同，最小的畸形細胞直徑僅為9 μm，最大可達100 μm；畸形細胞雖然染色體可增加許多倍，但是細胞不進行有絲分裂。當幼蜂完成在寄主體內(nèi)的發(fā)育時，畸形細胞的體積變小。

由圖2可以看出，蜂卵孵化時，漿膜釋放游離到寄主血淋巴中的畸形細胞的數(shù)目每胚胎平均為(150±32)個，隨著幼蜂的發(fā)育數(shù)量呈下降趨勢。其原因可能是畸形細胞的退化或寄主卵的胞吐作用或幼蜂的攝取。但Vinson and Lewis報道的寄生蜂體內(nèi)的畸形細胞的數(shù)目保持不變。從這一點來講，畸形細胞的數(shù)日變化還有待進一步的研究。

2．4畸形細胞的超微形態(tài)結構

在電光源顯微鏡(OBH型)下就能見到剛剛釋放的畸形細胞，大小與寄主血細胞相近，一般球形或橢圓形，呈亮白色(圖4)。通過掃描電鏡SEM觀察，1日齡畸形細胞的細胞核圓形或卵圓形，占據(jù)整個細胞的大部分體積，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器數(shù)量較少，細胞表面微絨毛短小且稀疏，脂滴和蛋白質(zhì)含量較少。當畸形細胞發(fā)育成熟達4日齡時，細胞核變大，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器數(shù)量增多，微絨毛較1日齡濃密并且更長，脂滴和蛋白質(zhì)含量也隨之增多，這表明畸形細胞代謝活動旺盛，吸收寄主營養(yǎng)和分泌蛋白質(zhì)的能力較1日齡增強(圖5)。由于試驗條件限制，本研究沒有觀察到Buron和Beckage報道的細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空腔，細胞衰老的情況。

3討論

現(xiàn)有資料表明，畸形細胞均來源于漿膜。寄生蜂蜂卵孵化時，漿膜分離成單個的或小的細胞團，隨蜂卵孵化釋放到寄主血淋巴中成為獨立分散的畸形細胞。本文研究表明畸形細胞由單層漿膜發(fā)育而成，這與秦啟聯(lián)研究的中紅側溝繭蜂(Microplitismediator)的畸形細胞的來源相一致。

因漿膜層中間部分退化后形成了畸形細胞，因此造成每胚胎釋放細胞的數(shù)量隨個體發(fā)育的不同而有差異，卵在體外培養(yǎng)所釋放的畸形細胞明顯少于煙蚜繭蜂在自然狀態(tài)下寄生所釋放的數(shù)量，并認為在自然狀態(tài)下寄生的煙蚜繭蜂所釋放的畸形細胞數(shù)量要多于溫室內(nèi)培養(yǎng)的煙蚜繭蜂的。并且，自然寄生和體外培養(yǎng)釋放的畸形細胞的直徑要明顯大于溫室內(nèi)的。從而表明，寄主的營養(yǎng)及生理條件影響畸形細胞的產(chǎn)生及隨后發(fā)育。

畸形細胞發(fā)育過程中，各種類型溶酶體和分泌酶的出現(xiàn)也說明了細胞內(nèi)部正經(jīng)歷著蛋白質(zhì)的分解代謝。當幼蜂即將完成在寄主體內(nèi)的發(fā)育時，畸形細胞的體積變小，這表明細胞正經(jīng)歷內(nèi)部的解體或向寄主中釋放了貯存的蛋白質(zhì)。

畸形細胞的數(shù)量在寄主體內(nèi)發(fā)育呈下降趨勢或完全消失。本研究認為畸形細胞數(shù)量下降或與幼蜂直接取食作用或與畸形細胞自身的變形、解體有關。但是至于畸形細胞，只是寄生蜂一般性的食物，還是具有其他特殊的生理方面的意義，這個問題還有待深入的研究。隨著幼蜂發(fā)育成熟，寄主血淋巴中生理條件的惡化，畸形細胞的活性下降。在解剖鏡下畸形細胞由明亮透明而轉變?yōu)槲郯咨蚨J為畸形細胞自身的瓦解是造成其數(shù)量下降的主要原因。本研究還表明，當畸形細胞發(fā)育體積達到最大時，正是幼蜂進入2齡，取食寄主血淋巴，進人生長和發(fā)育的快速增長期，這暗示了畸形細胞和幼蜂發(fā)育的同步性。