新疆棉花立枯病根際拮抗放線菌的篩選

紀春艷　王新榮　程路明　王純利

摘要：從采集的新疆棉苗根際土樣中經分離、純化獲得優勢放線菌菌株95個，采用平板對峙培養法對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)進行根際拮抗放線菌的篩選。結果表明．共獲得根際拮抗放線菌菌株22株，其中菌株M-1抑菌譜廣，抑菌活性強，熱穩定性較好，是一株具有良好應用潛力的防治棉花立枯病的生防菌。

關鍵詞：棉花；拮抗放線菌；立枯絲核菌；抑菌活性

中圖分類號：Q 939．92

微生物農藥作為生物農藥的重要類群，以其低毒低殘留、對非靶標生物及環境安全等特點而備受重視。放線菌是微生物農藥的重要來源，分布廣泛，種類繁多，篩選出的活性物質具有產業化生產的優勢。放線菌是植物根際微生物群落的重要組成部分，通過有效定殖，重寄生，產生抗生素、植物生長調節素，分泌幾丁質酶、葡聚糖酶、過氧化物酶等機制促進植株生長，抵抗病原菌的侵染。放線菌作為生防菌已在生產上被成功地應用，如土壤放線桿菌(Agrobacteriurn radiobacter 84)，利用其活菌制劑及其產生的抗生素(agriOcin-84)能夠有效防治核果和玫瑰根痛病。由立枯絲核菌(Rhizoctonia so-lani)引起的棉花立枯病是新疆棉花苗期的重要病害，對棉田的高產和穩產帶來嚴重影響。本研究從新疆主要棉花種植區的棉苗根際篩選到一批對立枯絲核菌抑菌效果較好的放線菌菌株，并對其中抑菌譜廣、抑菌活性強的菌株M-1進行穩定性的初步研究，現報道如下。

1材料與方法

1．1供試病原菌

立枯絲核菌：Rhizoctonia solani AG-4；尖孢鐮刀菌：Fusarium oxysporum；大麗輪枝菌：Verticillium dahliae Kleb；根串珠霉：Thielavi-opsis basicola；苧麻疫霉：Phytophthora boehmer-iae Sawada，以上菌株均由新疆農業大學植物病理室提供。

1．2培養基

土壤分離培養基：高氏1號培養基：瓊脂15 g，可浴性淀粉20 g，NaC1 0.5 g，KNO₃1 g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。

發酵培養基：可溶性淀粉45 g，花生餅粉22 g，(NH₄)2SO₄2.6 g，NaCl 2.6 g，CaCO₃2.6 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2。

馬鈴薯瓊脂糖培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

1．3棉苗根際土樣采集及根際放線菌的分離、培養

在新疆阿克蘇、昌吉、石河子、瑪納斯、呼圖壁、博樂6個棉花種植區進行采樣，采集棉花立枯病發病較嚴重的棉田中的健康棉苗(附帶根圍土)，裝入滅菌紙袋，低溫保存，進行分離。

將棉苗根上松散的附著土抖掉，自根莖處剪斷，稱取1 g根，用無菌水漂洗3次，置于9 mL無菌水的離心管中，制備不同稀釋液的根際土壤溶液，涂布于高氏Ⅰ號平板，28℃培養，觀察、計數，進行根際放線菌含菌量的測定，挑取不同形態的菌落畫線純化，鏡檢、保存。

對純化的根際放線菌菌株進行搖瓶發酵培養，250 mL三角瓶中裝入40 mL發酵培養基，接種量ф=10％，搖床轉速160 r／min，28℃振蕩培養4 d。

1．4拮抗放線菌的篩選

采用平板對峙培養法，將已培養3 d的立枯絲核菌用5 mm的打孔器打成菌絲塊，移到PDA平板的中央，將待篩選的放線菌的發酵培養液在離立枯絲核菌等距離的3個角上接種，每個角上放置的5 mm濾紙片上各滴加發酵液50μL，28℃培養，測量抑菌帶的寬度，觀察各放線菌菌株對立枯絲核菌的抑菌作用，選擇抑菌作用明顯的菌株作為拮抗放線菌。每個處理重復3次，以不接供試放線菌菌株的平板作為對照(CK)。

1．5抑菌譜的測定

將1.4中獲得的初篩拮抗放線菌菌株分別與棉花枯萎病(尖孢鐮刀菌)、棉花黃萎病(大麗輪枝菌)、棉花黑根腐病(根串珠霉)以及棉花疫病(苧麻疫霉)4種棉花病害的病原菌進行平板對峙培養，測定抑菌譜。

1．6菌株M-1穩定性的測定

將1.5中獲得的抑菌譜廣、拮抗活性強的菌株M-1發酵液經離心后所得的上清液進行以下穩定性測定。以發酵原液作為對照，重復3次。

1．6．1熱穩定性測定

將M-1發酵上清液分別于60、80、100、121℃處理60 min，對立枯絲核菌對峙培養，測定其抑菌圈的直徑。

1．6．2pH穩定性

將M-1發酵上清液的pH值分別調至2、4、6、8、10、12后，對立枯絲核菌對峙培養，測定其抑菌圈的直徑。

1．6．3紫外光穩定性

將M-1發酵上清液置于30 w紫外光下，距離30 cm，照射12 h后，對立枯絲核菌對峙培養，測定其抑菌圈的直徑。

2結果與分析

2．1棉苗根際放線菌分離和拮抗放線菌初步篩選

由表1可知，從阿克蘇、昌吉、石河子、瑪納斯、呼圖壁、博樂6個棉花種植區共采集棉苗根際土樣48份，不同地區的棉苗根際放線菌種群密度差異較大，其中石河子根際土壤的放線菌含量最高，而阿克蘇的最低。經分離、純化，共獲得優勢放線菌菌株95株，其中，瑪納斯土樣中獲得的放線菌菌株數較多，雖然石河子根際土壤中的放線菌含量最高，但其獲得的優勢放線菌菌株數最少，可能其根際放線菌的主要類群相對其他地區較單一。采用平板對峙法，測定95個放線菌菌株對立枯絲核菌的抑菌作用，初步篩選到有抑菌作用的拮抗放線菌22株，約占分離總株數的23％，初篩拮抗細菌菌株的抑菌活性強弱有所不同，可以分為3類：抑菌活性強(3級)的12株，占54％；抑菌活性較強(2級)的3株，占14％；抑菌活性較弱(1級)的7株，占32％。

2．2初篩拮抗放線菌菌株的抑菌譜測定結果

挑選2.1中的初篩放線菌22株，對4種棉花重要病害的病原菌進行抑菌譜的測定，結果見表2。由表2可知，抑菌譜可分為3類：(1)抑菌譜廣，對立枯絲核菌及其他供試菌株中的3個菌株均有很強的抑菌活性(3級)，如M-1，B-14等；(2)抑菌譜較廣，但對供試菌株的抑菌活性不一致，如：AF-2，M-4等；(3)抑菌譜窄，抑菌活性較低，僅對立枯絲核菌具有抑菌活性，而對其他供試菌株無抑菌活性，如AF-8，H-12。

2．3菌株M-1的穩定性

由圖1可知，與對照相比，M-1發酵液在80℃以下溫度處理60 min，對其抑菌活性沒有影響，經121℃處理60 min后，對立枯絲核菌仍然具有抑菌活性，M-1具有較好的熱穩定性。

與對照(pH7.2下，抑菌圈直徑為22.5 mm)相比，pH變化對M-1抑菌活性的影響如表3所示，在pH6～8之間穩定，pH4、pHl2下M-1的抑菌活性明顯降低，pH2時活性完全喪失。

將M-1發酵液經紫外光照射12 h后，抑菌圈的直徑為15.5 mm，對立枯絲核菌的抑菌活性明顯下降。

3討論

近年利用拈抗細菌對新疆棉花立枯病進行生物防治的研究已有相關報道。張亞平等從北疆棉花根際土壤中篩選到的芽孢桿菌7B-1能夠引起立枯絲核菌菌絲溶解和畸形；羅明等從新疆不同種植區的棉花植株組織中分離獲得一批對立枯絲核菌抑菌作用較強的菌株；閻小雪等篩選獲得對立枯絲核菌溫室防效較好的10株芽孢桿菌，其中有3株的田間小區試驗防效較好。有關對新疆棉花立枯病進行拮抗放線菌篩選的研究報道目前尚未見到。作者從新疆主要棉花種植區的棉苗根際篩選獲得一批對立枯絲核菌抑菌效果較好的放線菌菌株，其中菌株M-1對立枯絲核菌、大麗輪枝菌、根串珠霉以及苧麻疫霉的抑菌活性均很高，抑菌譜廣，熱穩定性較好，最適合的pH范圍為6～8，對紫外光敏感。這些為該菌株有效活性物質的分離純化提供了初步理論參考，下一步將對該菌株活性物質的純化鑒定、理化性質、最佳發酵培養條件的優化等進行深入研究。棉花立枯病是一類土傳苗期病害，植株在苗期的生長狀況與其抗病性密切相關，有必要對菌株M-1在棉株根部的定殖、是否具有促生長、誘導棉株抗病性產生等抑病機制進行系統研究，從而為大田應用提供必要的理論依據。