改造病毒基因組增強病毒殺蟲劑殺蟲效率研究進展

蔣　洪　周　亮　張珈敏　胡遠揚

摘要：由于基因工程技術的發展和安全性研究的深入，以重組桿狀病毒為主的重組昆蟲病毒殺蟲劑的應用正面臨著突破。文章綜述了通過修飾或刪除昆蟲病毒某些基因、插入控制宿主發育、代謝激素或酶的基因、刪除、修飾昆蟲病毒基因組中特定的基因以擴大宿主域、應用RNA干擾技術提高昆蟲病毒殺蟲效率等構建重組昆蟲病毒殺蟲劑的技術路線，展望重組病毒殺蟲劑的發展趨勢。

關鍵詞：重組病毒殺蟲劑；桿狀病毒；生物防治；殺蟲效率

中圖分類號：S 476．13

昆蟲病毒是以昆蟲為宿主，并可以在其種群中引發流行病的一類病毒。與大量使用的傳統化學殺蟲劑相比，以昆蟲病毒為有效成分的病毒殺蟲劑具有以下特點：防治效率高，不僅使用劑量極低，而且可以達到持續控制的效果；對人、畜、非靶標動物安全，保護天敵；極大減少了環境、食物的化學品殘留；增加了應用環境的生物多樣性；劑型便于儲運，有較長的貨架壽命；適合常規施藥方法，與害蟲綜合防治系統相容性好，正顯示日益強大的生命力。

但是，野生性的昆蟲病毒用作殺蟲劑也存在很多限制。與化學殺蟲劑相比，病毒殺蟲劑殺蟲速度慢，在害蟲被控制以前，可能已經造成了較大的損失。病毒殺蟲劑還有對紫外線敏感，需要活體增殖等缺點。另外，病毒對宿主的專一性導致的殺蟲譜狹窄也限制了其作為生物防治因子的廣泛應用。

為提高昆蟲病毒對宿主的殺蟲效率，應用現代分子生物學技術，可以通過昆蟲病毒基因組的基因工程提高病毒殺蟲劑的殺蟲效率、拓寬殺蟲譜。前文“應用昆蟲毒素基因構建重組病毒殺蟲劑研究進展”總結了插入昆蟲病毒基因組以構建重組病毒殺蟲劑的技術路線，現將應用調控昆蟲代謝、發育的基因、某些酶基因等外源基因重組昆蟲病毒提升控制宿主的效率、或通過刪除、修飾昆蟲病毒基因組內的某些基因增強病毒的殺蟲效率、擴大病毒的宿主域的研究進展進行綜述，全面反映重組病毒殺蟲劑的研究進展。

1修飾或刪除昆蟲病毒某些基因構建重組昆蟲病毒

寄生于宿主細胞內的昆蟲病毒，為了完成其生命活動和維持種群的增長，在與宿主長期的協同進化過程中，獲得了一些對宿主生理調控的功能，以使宿主生命維持相對長的時間，有利于昆蟲病毒在宿主細胞內完成增殖過程。例如AcMNPV基因組中的p35和iap基因可以抑制病毒感染引發的宿主細胞凋亡過程，關閉宿主細胞抗病毒機制。AcMNPV基因組中UDP葡萄糖基轉移酶基因(ecdysterioid UDP-giucoferase gene，egt)編碼蛻皮激素是一個重要的桿狀病毒調控基因。它可以通過把葡萄糖、半乳糖與蛻皮甾類激素偶聯而使后者失活，抑制宿主蛻皮和化蛹，以利于病毒在幼蟲體內增殖。研究表明，將egt基因失活構建的重組AcMNNPV可以使草地夜蛾(Spodoptera fru-giperda)幼蟲的死亡速度比野生型縮短30％，同時感染的幼蟲取食量顯著減少。插入外源片段使egt基因失活構建的重組AgMNPV感染大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)3齡幼蟲，與野生型AgM-NPV相比，半數死亡濃度LC₅₀降低3.9倍，死亡時間也顯著提前。

缺失egt基因的重組桿狀病毒的作用效果與幼蟲的齡期有關，主要影響5齡幼蟲的存活時間和取食量，可以使危害最大的5齡幼蟲半數死亡時間(LT₅₀)縮短33％，半數停止攝食時間(FT₅₀)縮短32％。在病毒基因組編碼egt的閱讀框ORF中插入昆蟲特異性毒素基因構建重組桿狀病毒，在失活egt基因的同時表達外源昆蟲毒素基因可以達到雙重增效目的。如插入螨蟲的tox34基因并使美洲棉鈴蟲核型多角體病毒(HzNPV)的egt基因失活所構建的重組HzNPV，感染美洲棉鈴蟲(He-liothis.zea)結果顯示，ET₅₀縮短到40h以內，只有野生型的40％。

昆蟲感染桿狀病毒的后期癥狀為蟲體發生液化，這是由于病毒編碼的幾丁質酶和組織蛋白酶表達后起的作用。桿狀病毒幾丁質酶基因C末端有一個編碼細胞內質網定位信號的KDEL閱讀框，其功能是使活化后的幾丁質酶定位于宿主細胞的內質網上。刪除KDEL閱讀框構建的重組病毒AcM-NPV感染昆蟲細胞后，幾丁質酶散布于細胞質內，并可以分泌出細胞外的培養基中。試驗結果發現，與野生型AcMNPV比較，基因組中刪除KDEL閱讀框的重組AcMNPV病毒感染粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的半數死亡時間LT₅₀從69 h縮短到61 h，半數致死劑量(LD₅₀)和對作物的損失都顯著降低。

2插入控制宿主發育、代謝激素或酶的基因構建重組昆蟲病毒

保幼激素(juvenile hormone，JH)是調控昆蟲體內組織分化的激素，起著保持幼蟲狀態，推遲化蛹的功能。保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase，JHE)則切割JH的甲基酯，使其失活。利用重組昆蟲病毒在宿主體內過量表達JHE，降低JH滴度，加速幼蟲的早熟和化蛹是構建重組桿狀病毒的另一條途徑。研究顯示，將在不同位置突變修飾的2個JH基因插入AcMNPV的p10啟動子下游構建重組病毒AcJHE-KK和AcJHE-sG，測試結果均表現出良好的殺蟲效果。與野生型相比，可以降低煙芽夜蛾(Heliothis virescens)對萵苣損失的66％和50％。

鱗翅目昆蟲組織的周圍由基底膜包圍，起著阻擋病原體侵入和病毒感染擴散的功能。在桿狀病毒基因組中插入相關的蛋白酶基因，在宿主體內表達后，可以酶解宿主昆蟲組織的基底膜，從而提高桿狀病毒的持續感染效果。試驗證實，將來源于蠅類的蛋白酶基因ScathL(組織蛋白酶L，屬于半胱氨酸蛋白酶)插入在AcMNPV的p6.9啟動子下游構建重組AcMNPV，與野生型相比，可以縮短煙芽夜蛾(H.virescens)存活時間50％，并且比在同樣位置插入蝎LqIT2毒素基因構建的重組病毒縮短30％。進一步研究顯示，該插入蛋白酶基因的重組AcMNPV攝食萵苣的量只有野生型的1／26。但是進一步研究發現，表達有效的或失活的ScathL基因并沒有對重組的AcMNPV病毒粒子在煙芽夜蛾幼蟲體內分布或定向擴散有明顯影響，基底膜能否作為昆蟲病毒在幼蟲體內擴散的阻擋屏障有待進一步研究。

3刪除、修飾病毒基因組中特定的基因以擴大宿主域。拓寬殺蟲譜

昆蟲病毒對宿主的專一性決定了其只能感染特定的一種或幾種宿主，限制了推廣應用。采用基因工程手段，通過改造桿狀病毒基因組，可以擴大其宿主域，從而拓寬病毒殺蟲劑的應用。

昆蟲病毒進入細胞的方式比較特殊，一般不需

要特異性的受體，或者與其結合的受體在動物細胞膜上廣泛存在，例如AcMNPV可以進入某些非允許的昆蟲和哺乳動物細胞。研究顯示，昆蟲病毒對宿主的專一性主要取決于病毒基因組在宿主細胞內的復制和晚期基因的表達，昆蟲體內的免疫系統也有作用心。

目前已知影響桿狀病毒宿主的基因有p143，p35，hrf-1等，重組此類基因有可能擴展宿主域。p143是桿狀病毒基因組中編碼解旋酶的基因，將AcMNPV的p143置換成BmNPV的p143構建重組AcMNPV，試驗證明，該重組AcMNPV的宿主域擴展到家蠶細胞系和幼蟲。插入舞毒蛾核型多角體病毒(LdNPV)的hrf-1基因構建重組AcMNPV，試驗結果顯示該重組病毒可以經口感染舞毒蛾(gypsy moth)，但是不能產生持續性的感染，可能是由于昆蟲細胞膜對非特異病毒的擴散有阻擋作用。

4應用RNA干擾技術提高昆蟲病毒殺蟲效率

利用桿狀病毒載體在宿主體內轉錄一段特定的RNA序列，該序列與宿主某個關鍵的基因轉錄產物(mRNA)互補，宿主這個在生長、發育過程中起重要作用的mRNA與載體轉錄的RNA互補后，失去翻譯功能，從而使該基因沉默。該技術路線直接作用于靶基因的轉錄環節，具有安全性好、作用時間提前等特點，是比較新的一條技術路線。

c-myc是廣泛存在脊椎動物和某些無脊椎動物體內的一個重要基因，其編碼的磷酸化核蛋白具有調控細胞分裂、休眠、分化、死亡等多種作用。將該基因中一段保守序列的互補DNA序列插入Ac-MNPV多角體啟動子下游構建重組病毒，感染草地貪夜蛾幼蟲。試驗顯示，感染3 d后，處理組75％的宿主幼蟲停止攝食，野生型AcMNPV同時間只有25％的幼蟲停止攝食，感染3 d通常是多角體啟動子開始表達的時間。處理組幼蟲停止攝食后，2 d內陸續死亡，比對照的野生型病毒感染組死亡時間提前1 d多。結果證實，利用RNA干擾技術可以顯著縮短宿主昆蟲停止攝食時間，并且幼蟲的蟲齡越小，效果越顯著。

5結語

病毒殺蟲劑規模化生產目前都以蟲體增殖的方式進行，具有投資少、生產工藝簡單、成本適中等優點。重組病毒由于表達了外源基因，增殖時宿主表現出進食少、發育緩慢、蟲體小、死亡快等癥狀，因而影響重組病毒的收獲。雖然重組病毒可以大大提高病毒殺蟲劑的控制效率，在其大規模應用之前，還必須解決生產的難題，達到商品化生產的要求。

隨著昆蟲病毒分子生物學研究的深入，可以預見將有更廣泛的昆蟲病毒通過基因工程提高其防治害蟲的應用潛力并被批準大田釋放研究，為農林害蟲和城市害蟲防治提供環境友好的生物防治技術。