一種細(xì)菌蛋白ＣＺ控制煙草花葉病毒（ＴＭＶ）的作用機理初探

吳惠惠等

摘要：以活性蛋白cZ處理NC89煙12 h后，摩擦接種TMV，1、5、8、12、16 d分別取各處理葉片測過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性及丙二醛(MDA)和葉綠素的含量。結(jié)果表明，POD和PAL2種酶的活性均比對照明顯提高；Cz處理使NC89煙葉片內(nèi)MDA的含量降低，而葉綠素的含量增高。電鏡下觀察到活性蛋白能打破TMV粒體的規(guī)則排列，與TMV粒體不可逆的結(jié)合，從而降低侵染力。

關(guān)鍵詞：煙草；煙草花葉病毒；活性氧防御酶系統(tǒng)；活性蛋白

中圖分類號：S 435，72，S 476，8

Verma等發(fā)現(xiàn)Clerodendrum aculeatum的葉片提取液可以系統(tǒng)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性；其機制是提取液中的一種堿性蛋白可以誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生一種抗病毒的蛋白阻止病毒的侵入。近年來，有關(guān)植物的抗性與活性氧代謝的關(guān)系備受人們的關(guān)注。細(xì)菌蛋白CZ是本實驗室人員在煙草種子周圍細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物中提純得到的一種抗病毒蛋白。研究表明，CZ對煙草花葉病毒病有明顯的控制作用，兼具保護(hù)作用，防效在54.74％～85.67％。電鏡下觀察到活性蛋白能打破TMV粒體的規(guī)則排列，與TMV粒子不可逆的結(jié)合，從而降低侵染力。本試驗以NC89、TMV為材料，從植物葉綠素含量及其防御酶系統(tǒng)變化的角度探討CZ的防病機理，為其應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1材料

普通煙NC89；TMV毒源保存在普通煙NC89煙上，細(xì)菌蛋白CZ由本實驗室提純制備，使用濃度為1.0614/μg/μL。

1.2處理植株

NC89在防蟲溫室中培養(yǎng)(20～27℃)，選擇5～6葉期，長勢一致、健壯的煙株供試。試驗設(shè)預(yù)防處理1和2，先用脫脂棉蘸取藥劑涂葉片施藥12 h后接種，另設(shè)對照只接種不施藥為處理3，藥劑為有一定濃度的活性蛋白CZ和3％超微蛋白微粒劑(康壯素，美國伊甸生物技術(shù)公司產(chǎn)品)，供試藥劑，共3個處理，每處理10株，重復(fù)3次，處理方法具體見表1。處理后1、5、8、12、16 d分別取各處理同一生育期、同一層次、同一葉位的葉片進(jìn)行POD活性、PAL活性、MDA含量及葉綠素含量的測定。

1.3接種方法

采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種，取病葉加去離子水研磨，(病汁液濃度為1 g病葉加80 mL水)，接種。

1.4酶活性及MDA、葉綠素含量測定

MDA含量采用張志良等的方法測定；葉綠素含量的測定采用張憲政等丙酮乙醇混合法；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法；PAL活性的測定按薛應(yīng)龍等的方法提取和測定。

1.5電鏡觀察活性蛋白CZ對TMV粒體的影響

1.5.1煙草花葉病毒的提純

TMV活體毒源NC89葉片100 g，研磨，離心去植株組織，按100 mL病毒澄清液加25 g硫酸銨的比例提純病毒。

1.5.2電鏡樣品制備(負(fù)染法)

取1 mL活性蛋白與等量的TMV提純液混合，以無菌水混合為對照，在室溫下(25℃)放置25 min后，用帶膜樣品載網(wǎng)膜面向下吸附1～3 min，取出濾紙吸干。用鑷子移到磷鎢酸(2％，pH6.7)中，染色1～2 min，取出濾紙吸干染液，放在墊有濾紙的平皿中，干燥后在JEM－100CX(放大倍數(shù)3 000×1.45)透射電鏡下，觀察病毒粒體形態(tài)。

2、結(jié)果與分析

2.1活性蛋白CZ對NC89煙葉片內(nèi)POD活性的影響

活性蛋白CZ對NC89煙葉片內(nèi)POD活性影響結(jié)果見圖1。

圖1表明，活性蛋白CZ和康壯素處理NC89煙后，第1～12天其葉片內(nèi)POD活性一直呈上升趨勢，且上升幅度和活性都明顯高于只接種TMV的葉片。第12～16天，POD活性呈下降趨勢，但是，活性蛋白CZ處理的煙草葉片中POD的活性下降幅度最小，明顯小于只接種TMV的葉片，略小于康壯素與TMV混合處理的葉片。由此可見，活性蛋白CZ處理煙草可以提高其體內(nèi)POD活性，具有一定的誘導(dǎo)抗病作用。

2.2活性蛋白CZ處理對NC89煙葉片內(nèi)PAL活性的影響

活性蛋白CZ對NC89煙葉片內(nèi)PAL活性影響結(jié)果見圖2。

圖2表明，活性蛋白CZ處理NC89煙后，第1～12天其葉片內(nèi)PAL活性一直呈上升趨勢，而只接種TMV的葉片內(nèi)PAL的活性在第1～5天有所下降，第5～12天雖然也呈上升趨勢，但上升幅度和活性都明顯低于活性蛋白CZ處理的葉片。第12～16天，幾種處理葉片中PAL活性雖然都呈下降趨勢，然而活性蛋白CZ處理的葉片中PAL的活性高于其他對照處理。

2.3活性蛋白CZ處理對NC89煙葉片內(nèi)葉綠素含量的影響

活性蛋白CZ對NC89煙葉片內(nèi)葉綠素含量影響的結(jié)果見圖3。

由圖3可見，NC89煙經(jīng)各處理后1～16 d內(nèi)，葉片內(nèi)葉綠素含量均呈下降趨勢，然而經(jīng)活性蛋白CZ處理的煙草葉片內(nèi)葉綠素含量的下降幅度略緩于其他處理，且其含量也高于其他處理。

2.4活性蛋白CZ處理對NC89煙葉片內(nèi)MDA含量的影響

活性蛋白CZ對NC89煙葉片內(nèi)MDA含量影響的結(jié)果見圖4。

由圖4可見，NC89煙株經(jīng)各處理后1～5 d內(nèi)，葉片內(nèi)MDA含量均有所上升，隨后第5～16天，各處理葉片內(nèi)MDA含量又都有所下降，但經(jīng)活性蛋白CZ處理的葉片內(nèi)MDA含量的上升幅度緩于其他處理，下降幅度又高于其他處理，并且其含量幾乎全程低于其他處理。

2.5活性蛋白對TMV粒體形態(tài)的影響

通過JEM一100CX電鏡觀察TMV的粒體形態(tài)：TMV與無菌水混合的圖片(圖5)，TMV粒體剛直、勻稱，呈桿狀，排列規(guī)則。而TMV與活性蛋白CZ混合的圖片，TMV粒體小片段數(shù)目多，排列凌亂，呈聚集狀(圖6)。這可能是因為活性蛋白破壞了病毒衣殼蛋白亞基之間的作用力，導(dǎo)致病毒粒體斷裂，結(jié)構(gòu)松散，排列凌亂，而小片段的病毒侵染力降低。

3、結(jié)論與討論

植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中危害非常廣泛而嚴(yán)重的一類植物病害。一般來說，抗病毒劑抗病毒作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：直接作用于病毒、作用于寄主上病毒侵染接受位點、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性及抑制病毒復(fù)制。近年來大量研究表明，植物葉綠素含量及其防御酶系統(tǒng)的變化與植物的抗病毒性關(guān)系密切。

(1)經(jīng)各處理后，NC89煙葉片內(nèi)POD活性及膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量發(fā)生了明顯的變化，表明TMV侵染NC89煙后，植株體內(nèi)發(fā)生了活性氧的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)的活性氧代謝在植物的致病過程中起重要的作用。活性氧的清除主要通過POD等有關(guān)的酶和一些能與自由基反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定產(chǎn)物的有機分子共同擔(dān)負(fù)的。其中POD是細(xì)胞體內(nèi)重要的活性氧清除劑，能使活性氧維持在一個低水平，防止活性氧傷害。在植物生長發(fā)育過程中其活性不斷發(fā)生變化。因此，測量這種酶可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝存在于植物細(xì)胞中清除自由基的主要酶之一。而通常MDA含量作為膜脂過氧化的指標(biāo)，表明細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強弱，MDA值越高說明病毒對于植物細(xì)胞組織的破壞越強。本研究結(jié)果表明，NC89煙經(jīng)活性蛋白CZ處理后，葉片中POD活性增加，MDA含量降低，這表明活性蛋白CZ對TMV的拮抗作用可能與活性氧代謝有關(guān)，即可減少活性氧對植物的毒害作用。

(2)在高等植物次生代謝物中，PAL是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮色素等合成密切有關(guān)，在植物正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用，是植物誘導(dǎo)抗病性的常用的酶活指標(biāo)。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)活性蛋白CZ處理后，NC89煙葉片內(nèi)的PAL活性均比對照增加，其酶活性的提高可能導(dǎo)致細(xì)胞壁的木質(zhì)化作用的加強和細(xì)胞內(nèi)植保素的形成，細(xì)胞壁的木質(zhì)化加強可能阻止病毒的侵染；植株體內(nèi)的植保素也可能對病毒有影響，這需要進(jìn)一步研究。

(3)活性蛋白CZ可誘導(dǎo)葉綠素含量升高而增強寄主植物的抗病性植物葉片中的葉綠素含量與植物抗病毒能力關(guān)系密切，葉綠素含量高，光合作用強，植物生長旺盛，抗病性和耐病性增強。當(dāng)病毒侵染葉片后，不斷增值擴展，而且能和葉綠體發(fā)生相互作用，導(dǎo)致葉綠體的解體，發(fā)病嚴(yán)重的葉綠素合成受阻，葉片黃化褪綠，出現(xiàn)花葉癥狀，因此葉綠素含量高低可以客觀地反映植物對病毒抗性的強弱。目前，有許多抗病毒劑含有激素或具有激素活性，可刺激植物生長而提高其抗病性。研究結(jié)果表明，煙草經(jīng)活性蛋白CZ處理后，其葉片中的葉綠素含量高于其他處理，說明活性蛋白CZ增強寄主植物的抗病性，但關(guān)于其機理則有待于進(jìn)一步探討。

(4)本試驗篩選出的對TMV有拮抗作用的菌株，其分泌的抗病毒蛋白對TMV粒子亦有體外鈍化作用；電鏡下觀察到抗病毒蛋白打破TMV粒子的規(guī)則排列，有一定的聚集作用，從而降低病毒粒子的侵染力，具有研究價值。