熱帶洋蘭葉斑病病原菌生物學特性研究和防治藥劑篩

陳燕紅等

摘要：對熱帶洋蘭葉斑病病原菌串珠鐮刀菌BlOb開展了寄主范圍、生物學特性研究，并對其進行了防治藥劑毒力測定。結果表明：人工接種后該病原菌能侵染石斛蘭、蝴蝶蘭、大花蕙蘭和文心蘭葉片并引起典型葉斑病癥狀；其菌絲生長的最適溫度范圍為25～28℃，最適pH7～8；甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉是其最佳生長碳源，牛肉膏和蛋白胨是最適氮源；菌絲和孢子的致死溫度為65℃ 30 min異菌脲、腈菌唑對菌絲生長的抑制作用很強，其EC₅₀分別為1.12×10^-5μg/mL和1.5254μg/mL，甲基硫菌靈和代森錳鋅的效果較弱，其EC₅₀分別為105.8798μg/mL和66.830 2μg/mL。

關鍵詞：熱帶洋蘭；葉斑病；生物學特性；毒力測定

中圖分類號：S 436，8

熱帶洋蘭因其經濟價值較高，在南方各省廣泛栽培。但其規模化生產和密集栽培，以及高溫高濕的特殊培養條件有利于病原微生物大量繁殖，嚴重影響了蘭花的生長及經濟價值。熱帶洋蘭的常見病害包括葉斑病、白絹病、黑點斑病、褐斑病、枯萎病等。其中葉斑病主要危害葉部，一般從葉尖開始發病，發病葉片的正反面、葉尖及葉邊緣均可出現褐斑或黑斑。有時相鄰病斑融合成大病斑，處于邊緣的病斑也多連成線狀，嚴重時葉片萎黃，目前發現危害熱帶洋蘭的葉斑病有多種，其中以尾孢葉斑病、擬盤多毛孢葉斑病、散斑殼葉斑病和葉點霉葉斑病較為普遍。

珠海市農業科學研究中心自1999年開始規模化生產熱帶洋蘭，在生產過程中發現了一種由串珠鐮刀菌引起的熱帶洋蘭(包括石斛蘭、文心蘭和大花蕙蘭等)葉斑病，此病雖不能造成整株死亡，但因其極易發病，發病規模大，從而增加了洋蘭生產成本，而且發病后的病斑降低了其質量和商品價值。本文針對該病原菌開展了寄主范圍、生物學特性以及防治藥劑毒力測定等研究，為洋蘭的栽培管理和病害防治提供依據，以指導生產實踐。

1、材料與方法

1.1材料

供試菌株：串珠鐮刀菌B10b，分離自患病石斛蘭，珠海市農業科學研究中心生物防治技術實驗室保藏。

供試植物：石斛蘭(熊貓一號、蝴蝶石斛、春石斛和迷你石斛)、文心蘭(黃金一號)、蝴蝶蘭(大紅花線條)、大花蕙蘭，珠海市農業科學研究中心蘭花資源圃提供。

1.2病原菌的寄主范圍研究

根據柯赫氏法則，采用無傷接種和致傷接種兩種方式測定了病原菌孢子和菌絲體對石斛蘭、文心蘭、蝴蝶蘭、大花蕙蘭(苗齡為1～2年)的致病性。每個處理3個重復，一個重復1株苗，每株苗接種3片葉，另設兩組不接菌的苗為對照。然后將各種供試蘭花苗置于溫度為26～29℃，相對濕度為80％～90％的溫室中培養。每天觀察記錄其發病情況。

1.3病原菌的形態學觀察

將分離得到的菌株接種于PDA平板上，28℃培養7 d后，觀察菌落形態。利用載玻片培養法培養菌株，在不同培養時間取出載玻片觀察菌絲和分生孢子的形態。

1.4生物學特性研究

1.4.1溫度對菌絲生長的影響

用PDA平板培養病原菌7 d以活化，然后用直徑為5 mm的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌塊，將其接種于新鮮PDA平板中央，將平板分別置于16、20、25、28、30、35、40℃下培養，每個溫度重復3次。分別在培養3 d和6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.2 pH對菌絲生長的影響

在無菌條件下用無菌氫氧化鈉(1 mol/L)和鹽酸(1 mol/L)調節高壓滅菌后的PDA培養基的pH為3.0、5.0、7.0、8.0、10.0和12.0，然后將直徑為5 mm的菌塊分別接種于不同pH的PDA平板中央，每個處理重復3次。28℃培養3 d和6 d后用十字交叉法測定菌落直徑。

1.4.3不同碳、氮源對菌絲生長的影響

1.4.3.1不同碳源對菌絲生長的影響

以查彼克(Czapek)培養基為基礎，用含有相當碳的不同碳源(葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、甘露醇)代替查彼克培養基中的蔗糖，配成含不同碳源的固體培養基，以不含蔗糖的查彼克固體培養基為對照，每個處理重復3次。28℃培養3 d和6 d后用十字交叉法測定菌落直徑。

1.4.3.2不同氮源對菌絲生長的影響

以查彼克培養基為基礎培養基，用含有相當氮的不同氮源(牛肉膏、蛋白胨、硝酸鈉、甘氨酸、L—精氨酸、脲、氯化銨)代替此培養基中的硝酸鉀，配成含不同氮源的固體培養基，以不含硝酸鉀的查彼克培養基為對照，每個處理重復3次，28℃培養3 d和6 d后用十字交叉法測定菌落直徑。

1.4.4光照對菌絲生長的影響

按1.4.1的方法將病原菌菌塊接種于PDA平板上，然后分別置于：(1)8 w日光燈下連續光照；(2)12 h光暗交替；(3)連續黑暗條件下。每個處理重復3次，28℃培養3 d和6 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.5菌絲和孢子致死溫度測定

1.4.5.1菌絲致死溫度

將直徑為5 mm的菌塊分別置于已預熱到45、50、55、60℃和65℃的含2 mL無菌水的小試管中，每支小試管5個菌塊，然后將試管置于相應溫度的水浴鍋中處理30 min后，取出菌塊置于PDA平板上，28℃培養14 d后觀察其生長情況。

1.4.5.2孢子致死溫度

分別用已預熱到45、50、55、60℃和65℃的無菌水將孢子配成1.3×10⁶個／mL的懸浮液，然后將其分別置于相應溫度的水浴鍋中處理30 min。每個溫度3個重復，72 h后用血球計數板觀察孢子萌發情況，并計算萌發率。

1.5藥劑對病原菌菌絲生長的影響

采用藥皿抑菌法測定供試藥劑的EC₅₀。根據毒力預備試驗，將供試藥劑用紫外燈照射2～3 h除菌后，用無菌水按倍數逐步稀釋配成3個系列濃度，然后與50～55℃的PDA培養基混合均勻，制成不同濃度的含藥平板。每皿中央接種直徑為5 mm的菌塊，重復3次，以不加藥劑只加相同量無菌水的處理為對照。在28℃恒溫培養7 d，測量菌落直徑，按如下公式計算抑菌率，利用概率值法求出各藥劑的毒力回歸曲線，并計算EC₅₀。

供試藥劑包括70％甲基硫菌靈可濕性粉劑(甲基托布津，日本曹達株式會社)、50％代森錳鋅可濕性粉劑(利民化工有限責任公司)、50％異菌脲懸浮劑(撲海因，拜耳杭州作物科學有限公司)、12.5％腈菌唑乳油(深圳諾普信農化股份有限公司)。

抑菌率計算：抑菌率＝(對照菌落直徑－處理菌落直徑)／對照菌落直徑×100％。

1.6數據分析

用SPSS(13.0)軟件對數據進行方差分析，平

均值用LSD測驗進行顯著性差異比較(p≤0.05)，使用Excel軟件獲得毒力回歸方程并計算EC₅₀。

2、結果與分析

2.1病原菌的形態特征

此菌在PDA平板上菌落平坦，形成數個同心圓；培養過程中能分泌紫紅色色素，平板背面紫紅色；氣生菌絲白色、致密、棉絮狀，有隔，隔膜為雙層膜，內部有較多點狀內含物。瓶梗狀分生孢子梗單枝或多枝。分生孢子無色，有大小兩種：大型分生孢子少，微彎曲，為不對稱的擬紡錘形，1個隔膜，大小為(3.96～15.3)μm×(1.32～4.95)μm；小型分生孢子卵圓形，無隔，成串或假頭狀。經廣東微生物所鑒定為串珠鐮刀菌。

2.2病原菌寄主范圍

致傷與無傷2種接種方式均可引起供試洋蘭發病，其中致傷接種發病較快，24 h內出現癥狀，72 h已形成較大病斑，直徑達0.7～1 cm；無傷接種48 h后才出現幾個黑色斑點，72 h后病斑增多并擴大，直徑達0.1～0.3 cm；而且在這些患病葉片的病健交界處分離出與B10b相同的病原菌。結果顯示，該病原菌能引起石斛蘭、蝴蝶蘭、文心蘭和大花蕙蘭等熱帶洋蘭的葉斑病，其寄主范圍較廣。

2.3生物學特性

2.3.1溫度對菌絲生長的影響

溫度能夠顯著影響菌絲生長(表1)，B10b在測試溫度范圍內均能生長，但其最適溫度范圍為25～28℃，35℃及以上的溫度會抑制菌絲的生長。

2.3.2 pH對菌絲生長的影響

pH對菌絲生長影響顯著(表2)。B10b的pH耐受范圍較廣，在pH 3～12范圍內均能生長，但適宜其生長的最佳pH范圍為7～8，說明該菌適宜在微堿環境中生長。pH升高或降低均會影響其生長，使菌落直徑變小。但隨著培養時間的延長，堿性培養基對其生長的抑制作用減弱；而酸性培養基則顯著影響其生長，表現為生長緩慢，菌落直徑較小，菌絲稀疏，產生較少色素。

2.3.3碳源對菌絲生長的影響

碳源對菌株B10 b的生長有明顯的影響(表3)，該菌株能在無糖培養基中生長，但對甘露醇、麥芽糖、可溶性淀粉的利用效果較好，菌絲生長較快。最初對木糖的利用效果不太好，但隨著時間的推移，菌株對其的利用效果得到了提高。

染石斛蘭、文心蘭、蝴蝶蘭和大花蕙蘭，并在葉片形成黑色小斑點。通過研究該病原菌的生物學特性發現，該菌的溫度適應性較廣，能夠在16～35℃范圍內生長，最適溫度范圍為20～30℃，與洋蘭生長的適宜溫度范圍吻合。B10b菌株適宜在pH7～8的偏堿性環境生長，能夠利用多種碳氮源，甚至在沒有碳源或氮源的條件下也能生長，黑暗交替的光照條件更適合菌株生長，這些特點表明此病原菌有較強的生存能力，對洋蘭的生產具有極大的危害性。

本文選擇殺菌機理不同的4種藥劑開展毒力試驗，其中異菌脲對本菌株的毒力最強，其EC₅₀最小，其次是腈菌唑，但代森錳鋅和甲基硫菌靈對菌株的毒力較小；研究還發現紫外線照射能夠提高甲基硫菌靈的殺菌效果，但不會影響其他3種藥劑的效果。異菌脲通過抑制蛋白激酶，干擾細胞內信號傳導，從而抑制真菌孢子萌發、產生以及菌絲生長；腈菌唑則通過抑制麥角甾醇生物合成，從而干擾病原菌正常生長和抑制孢子形成；代森錳鋅通過抑制菌體內丙酮酸的氧化以及和蛋白質體上的巰基結合達到抑菌效果，屬于保護性殺菌劑；甲基硫菌靈主要影響細胞分裂從而達到抑菌的效果。顯微觀察不同藥劑處理后的病原菌菌絲發現菌絲表現出不同的異常現象：在異菌脲和腈菌唑藥皿上生長的菌絲，與正常菌絲比，表現出節狀膨大，內含物較多，內含顆粒較小而且形狀多變；在甲基硫菌靈藥皿上的菌絲表現出分支較少，內含物形狀規則，圓形，顆粒較大，成直線排列；在代森錳鋅藥皿上的菌絲則幾乎不含內含物。不同殺菌劑對菌株的毒力效果可能與殺菌劑的作用機制密切相關，也可能與溫室生產中長期使用代森錳鋅和甲基硫菌靈引起菌株的抗藥性有關。