寡聚半乳糖醛酸誘導煙草抗煙草花葉病毒研究初探

盧　航等

摘要：用寡聚半乳糖醛酸誘導煙草抗煙草花葉病毒，田間和溫室試驗結果表明，寡聚半乳糖醛酸50μg/mL的誘抗效果最好，對煙草花葉病毒引起的枯斑的抑制率為64.4％。寡聚半乳糖醛酸可以誘導煙草植株抗性酶超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的升高。

關鍵詞：寡聚半乳糖醛酸；誘導抗性；煙草花葉病毒；防效

中圖分類號：S 482，292

煙草病毒病有煙草癌癥之稱，一旦發生和蔓延，就難以控制，嚴重制約煙草的正常生長。目前發生最普遍、危害最嚴重的是煙草花葉病毒(TMV)，其發生范圍遍及各煙區，不僅造成煙草產量的損失，而且使煙草品質嚴重下降，降低煙草的煙葉等級，嚴重影響煙葉的經濟性狀。化學藥劑所造成的病原物抗性和環保問題，使其應用受到較多限制；由于植物病毒系活體寄生物，侵入寄主細胞后的增殖需借助寄主的代謝，因此至今尚無安全、有效的治療藥劑。而誘導抗性作為對植物病害的誘導應答減少了植物在抗病方面所付出的種種代價，因此是較為經濟有效的抗病策略，并在作物可持續病害防治中具有十分廣闊的應用前景。本文著重研究寡聚半乳糖醛酸誘導煙草抗煙草花葉病毒的能力，以期為寡聚半乳糖醛酸用于農業生產提供科學依據。

1、材料和方法

1.1供試藥劑

寡聚半乳糖醛酸以及殼寡糖，由中國科學院大連化物所研制。20％病毒A可濕性粉劑，黑龍江省齊齊哈爾四友化工實業有限公司生產，市購。

1.2供試植物

枯斑三生煙。

1.3供試毒源

煙草花葉病毒(TMV)，本實驗室保存于普通煙上。接種病毒汁液為含TMV的煙草病葉，加入5倍體積0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)，在研缽中研磨后用紗布過濾。

1.4田間試驗

供試藥劑寡聚半乳糖醛酸設濃度為50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL，病毒A稀釋700倍，另設清水對照，共5個噴霧處理。

試驗地設在海南，土壤為紅土。選用長勢大小一致的6～8葉期的煙草每個處理15株，葉面噴霧施藥。24 h后汁液摩擦接種TMV病毒。在病毒汁液中加入少量石英砂，用毛筆蘸取汁液摩擦接種。枯斑三生煙苗采用半葉法接種，每株接4片葉。接種后每天觀察發病情況。待全面發病后，調查病斑數。

1.5溫室試驗

選取大小一致、6～8葉期的煙草植株，均勻噴灑供試藥劑寡聚半乳糖醛酸50μg/mL。處理24～96 h不同時間后，進行接毒試驗。采用半葉法摩擦接種。接種7 d后，統計葉片上的病斑數。試驗重復3次，計算抑制率。

抑制率一[(對照葉片病斑數一處理葉片病斑數)／對照葉片病斑數]×100％。

1.6抗性相關酶的測定

1.6.1超氧化物歧化酶(SOD)活性

取樣葉1.4g，10.0mL含5mmol／L巰基乙醇的硼酸緩沖液(0.05mol/L，pH8.8)，加入0.5gPVP和石英砂在研缽中研磨，在冰水中研磨成漿。10000r/rain，4℃離心10min，上清液即為酶液。3mL反應體系中含50mmol/L磷酸緩沖液，13mmol/L甲硫氨酸，75μmol/L氮藍四唑(NBT)，100nmol/L EDTA，4μmol/L核黃素，加入50μL粗酶，在日光下反應，以黑暗終止反應，立即在560nm下比色。以抑制NBT光化還原的50％為1個酶活單位。以不加酶液的光照管為對照。以磷酸緩沖液調零。

1.6.2過氧化氫酶(CAT)活性

3 mL反應體系中含50 mmol/L pH7.0PBS1.9mL，45mmol/L H2O2(2％)1.0mL和0.1mL酶液。連續記錄240nm吸光度的變化。以1 min變化0.01為1個酶活單位。

2、試驗結果

2.1田間試驗

試驗結果表明，殼寡糖、寡聚半乳糖醛酸50、75、100μg/mL，以及病毒A稀釋700倍都對煙草花葉病毒侵染煙草產生枯斑有抑制效果。其中寡聚半乳糖醛酸50μg/mL抑制效果最好，抑制率為52.8％，略高于陽性對照殼寡糖(49.7％)以及病毒A(31.8％)。寡聚半乳糖醛酸75μg/mL以及100μg/mL，抑制率分別為為49.7％和37.9％，都高于病毒A稀釋700倍。寡聚半乳糖醛酸濃度在50～100μg/mL期間是隨濃度的增加，抑制率有所降低。

2.2溫室試驗

取田間試驗誘抗效果最好的寡聚半乳糖醛酸濃度50μg/mL進行溫室試驗，試圖尋找誘抗效果最好的時間點。試驗結果表明(3次重復)，噴施寡聚半乳糖醛酸96 h時，隨著時間的延長誘抗效果越明顯，枯斑產生的抑制率為62.2％，但是差異不顯著，說明96 h內寡聚半乳糖醛酸誘導效果基本維持穩定。

2.3寡聚半乳糖醛酸處理煙草后抗性相關酶活性

變化

2.3.1超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

寡聚半乳糖醛酸處理煙草植株后SOD的活性變化如圖3所示。處理煙草15min～12h的時間內，SOD酶活性升高，均高于對照。其中處理1h內就達到第1個峰值。8～12h達到第2個峰值。推測寡聚半乳糖醛酸誘導煙草首先能夠產生一個快速的SOD活性升高的反應，然后在8～12h時能夠誘導另外一個途徑使SOD酶活升高。

2.3.2過氧化氫酶(CAT)活性變化

寡聚半乳糖醛酸處理煙草植株后，CAT活性明顯高于對照，處理15min～2h即達到峰值。在處理后的148h內，CAT均可保持較高的活性。說明寡聚半乳糖醛酸在2 h內可以快速誘導CAT的活性，并且可以在較長時間保持誘導煙草植株CAT的活性。

3、結論與討論

目前，對于寡聚半乳糖醛酸作為植物誘導子的研究比較多，但是對于誘導煙草抗煙草花葉病毒的研究較少，本實驗室研究了寡聚半乳糖醛酸誘導煙草抗性的最佳濃度為50μg/mL，96 h以內的誘導抗性不依賴于誘導時間的長短。本實驗室也檢測了誘導時間長達25 d的誘抗效果，誘導抗性隨時間的延長而先增加后降低，在16 d達到最高。

植物體在抵抗病原菌侵染的過程中，有些保護反應是在酶催化下完成的。許多研究結果表明，植物在逆境條件下，其膜系統的受損與生物氧自由基有關，超氧化物歧化酶SOD被認為是細胞膜的保護酶。酶活性愈高，消除氧自由基的能力越強。植物的抗逆性也愈強。抗病毒劑VA誘導枯斑三生煙后，葉片中SOD活性增加，推測VA誘導枯斑三生煙對TMV的抗性可能與活性氧代謝有關，即可減少活性氧對植物的毒害作用。另外，其他的能夠誘導煙草抗TMV的誘導子如VFB以及落葵提取液，均可誘導煙草中SOD酶活性的增加。本文寡聚半乳糖醛酸能夠誘導煙草抗病毒，并且也伴隨著SOD酶活性的升高，間接說明SOD酶活性的升高與植物抗病毒有關系。

過氧化氫酶(CAT)是植物細胞內重要的活性氧清除劑，其生理作用是將H₂O₂還原為H₂O和O₂。CAT活性升高或H₂O₂含量降低意味著活性氧對植物細胞傷害程度的降低。病原菌侵染煙草后，總體上看，抗病品種CAT活性高于感病品種。孔凡明等通過煙草與TMV不同互作體系的研究表明，接種后CAT活性均升高，在非親和性互作的早期，CAT活性顯著高于親和性互作。因此推測，寡聚半乳糖醛酸誘導煙草植株CAT活性的升高，有利于提高植物抗病毒的能力。但是對于誘導煙草抗性的具體機理還有待于進一步的研究。