線蟲乙酰膽堿酯酶研究進展

丁　中等

摘要：線蟲乙酰膽堿酯酶(ACHE)以多種不同的分子型存在并由不同的基因所編碼。本綜述簡述了線蟲AChE的藥理學特性、分子型以及相關ace基因的結構、分布和功能。

關鍵詞：線蟲；乙酰膽堿酯酶；分子型；ace基因

中圖分類號Q 78：S 432，45

線蟲依靠沿蟲體體壁縱向排列的背肌帶和腹肌帶的收縮而獲得蠕行的動力。在線蟲的腹神經索和背神經索存在神經一肌肉突觸，通過興奮性神經遞質乙酰膽堿(ACh)以調節肌肉活動。乙酰膽堿酯酶是生物神經傳導中的一種關鍵性的酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞。當AChE受到有機磷類和氨基甲酸酯類藥劑抑制時，ACh在突觸內聚集，先引起突觸后膜乙酰膽堿受體的高度興奮，然后產生去極化作用，導致蟲體麻痹。植物寄生線蟲麻痹后，由于不能找到寄主和食物而死亡。動物寄生線蟲如巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)等，AChE除了其正常的神經學功能外，它還是一種分泌性產物，但對于分泌性AChE的生理功能目前仍有爭議。當AChE受到抑制同樣將導致線蟲麻痹，使動物寄生線蟲從宿主體內排出。

1、線蟲AChE的分子型(molecular forms)

過去曾長期認為線蟲和大多數無脊椎動物、所有的脊椎動物一樣均由單基因編碼AChE并只有單一分子型，但通過對自由生活線蟲秀麗小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)，動物寄生線蟲如捻轉血矛線蟲(Haemonchus contortus)、蛔蟲(Ascarislumbricoides)等和植物寄生線蟲如南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)、大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)等的研究表明，線蟲的AChE以多種分子型存在。對其分子結構分析表明，這些形式的酶不具有其他種類動物中常見的、與許多AChE有關的膠原尾，而是球形的單體(G1)、二聚體(G2)和四聚體(G4)，并依據其溶解性又可分為兩親分子(amphiphilic)和非兩親分子(nonamphipilic)。這些分子型又組成了AChE的不同類型，并由多種基因所編碼，其編碼不同的動力學類型在底物的親和性、對抑制劑的敏感性等性質方面均有明顯不同。這些酶類在線蟲體內量的多少和分布可能是影響抑制劑對線蟲行為作用的重要因素，并發現許多種動物寄生線蟲能通過側器腺體活躍地分泌AChE。這些分泌性AChE與在神經一肌肉突觸間的AChE有著明顯的差異。

2、線蟲AChE的藥理學特性

氨基甲酸酯類和有機磷類殺線蟲劑與AChE的結合方式類似于天然底物，首先形成一個復合體，然后AChE活性部位的絲氨酸殘基被氨基甲酰酯化或磷酰化，這就造成了酶的被抑制。早期的研究發現有機磷類和氨基甲酸酯類殺線蟲劑的一個共同特征是具有與AChE作用的可逆性。幾種植物寄生線蟲經有機磷和氨基甲酸酯抑制劑作用后可恢復活動。如燕麥真滑刃線蟲(Aphelenchus avenae)經涕滅威作用72 h后再經過在蒸餾水中48 h的恢復，線蟲AChE的活性恢復率高達98％，而經苯線磷作用后的恢復率僅約6％。秀麗小桿線蟲經氨基甲酸酯類和有機磷類作用24 h后，線蟲AChE的恢復迅速，其中涕滅威作用過的線蟲經24 h的恢復期后，線蟲的AChE活性幾乎完全恢復，但經苯線磷抑制的線蟲在24 h恢復期后，與未經藥物作用的線蟲相比，僅觀察到約10％的AChE活性，但這樣小量的AChE活性恢復已足以使線蟲恢復正常活動。

經氨基甲酸酯類殺蟲劑麻痹的線蟲與未經藥劑作用的線蟲相比，前者仍具有較高的AChE活性。氨基甲酸酯類涕滅威抑制AChE活性的動力學試驗證明，抑制表現出兩個階段，即約50％AChE活性喪失較快，而剩余的部分則被抑制得較慢。在經長達24 h的持續作用后，線蟲的AChE可被完全抑制。基于以上現象的觀察和采用去污劑皂甙所做的試驗數據，Russell曾猜測AChE可能存在于兩個室(compartment)內，并由脂膜分隔開，第1室可能存在于神經一肌肉突觸，AChE可迅速失活，是與線蟲行為相關的部分；第2室AChE的被抑制極為緩慢，可能與線蟲行為無關。但后來認為，這是由于線蟲中存在對抑制劑具有高度抗性的AChE類型所致。

3、線蟲AChE的基因結構、功能和組織分布

近年來對多種線蟲尤其是以秀麗小桿線蟲為模式線蟲對AChE的相關基因進行了克隆和測序，揭示了其結構、組織的分布并推測了其分別演繹的功能。發現線蟲的乙酰膽堿酯酶由多種基因所編碼。對秀麗小桿線蟲的遺傳分析認為編碼AChE的有4種基因ace-1、ace-2、ace-3和ace-4，分別編碼4種不同AChE類型。其基因結構見圖1。在染色體X上的ace-1編碼ACE-1，染色體工上的ace-2編碼ACE-2，染色體Ⅱ上的ace-3編碼ACE-3。缺失ace-1或ace-2的秀麗小桿線蟲突變體在行動上僅有輕微的改變，而缺失ace-3的突變體則未觀察到行為或發育異常。缺失ace-1和ace-2線蟲運動上表現出嚴重的不協調，缺失ace-1、ace-2和ace-3的3個基因的突變體則致死。

3.1ACE-1

編碼秀麗小桿線蟲ACE-1的ace-1基因與編碼人類以及電鰩(torpedo)的AChE基因具有42％的同源性，主要分布在線蟲的體壁肌細胞。秀麗小桿線蟲和Caenorhabditis briggsae的ACE-1是一個兩親分子四聚體，具有一疏水的非催化亞基，與脊椎動物的AChE催化亞基AChE(T)相類似，并在花生根結線蟲(M.arenaria)和南方根結線蟲中發現同樣也有該亞基。最近作者克隆并推導的甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)乙酰膽堿酯酶ACE-1(待發表)與秀麗小桿線蟲、南方根結線蟲、胎生網尾線蟲(Dictyocaulus viviparus)的ACE-1高度同源。這些ACE的C-末端序列均具有色氨酸兩親分子四聚體(WAT)區域，該區具富含脯氨酸結合區(PRAD)。與秀麗小桿線蟲ACE-1基因序列中有8個保守芳香族氨基酸殘基相比較，南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和甘薯莖線蟲只有7個保守的芳香族氨基酸。

采用綠色熒光蛋白(GFP)報告基因結構通過顯微注射法證明了秀麗小桿線蟲的ace-1表達的空間分布。觀察到ace-1在所有的體壁肌細胞、咽肌細胞pm5和頭部神經中樞的3對感覺神經元都有表達。咽肌細胞對取食非常重要。咽的汲動通過神經元M5受膽堿能支配的調節，并發現ace-1、

ace-2均缺失的突變體咽功能有缺陷。研究發現ace-1在南方根結線蟲和爪哇根結線蟲的大多數生長階段都能表達，但在雌成蟲則未能檢測到。由于雌成蟲在植物根部組織是不遷移的，秀麗小桿線蟲缺失ace-1的突變體其咽部汲動功能并未受到影響。因此，ace-1的表達與否對根結線蟲雌成蟲的生存不是必需的。

3.2ACE-2

秀麗小桿線蟲的ACE-2是一種結合有糖基磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)結構的兩親分子二聚體，其C末端是疏水的，與脊椎動物ACHE(H)結構非常相似，都有一個GPI錨定位點并在錨定位點的上游含有一個半胱氨酸殘基，參與鏈間二硫鍵的形成。

從南方根結線蟲、胎生網尾線蟲(Dictyocaulusviviparus)和甘薯莖線蟲克隆的cDNA與秀麗小桿線蟲的ace-2均具有高度的同源性。但與秀麗小桿線蟲、南方根結線蟲和胎生網尾線蟲的ACE-2相比較，作者在甘薯莖線蟲ACE-2的C末端未發現半胱氨酸殘基。這是否意味著該酶活性的改變有待進一步研究。

采用GFP報道基因顯微注射法表明ace-2與ace-1具有不同的表達部位：ace-2主要在頭部的感覺神經細胞、pm5細胞以及肛門神經節和真皮細胞下的運動神經元得到表達。而且ace-2是秀麗小桿線蟲賁門表達AChE的唯一基因。通過RT-PCR技術研究發現，ace-2在南方根結線蟲的卵孵化前的一齡幼蟲及孵化后的生長階段包括雌、雄蟲均能表達。由于ace-1在南方根結線蟲雌成蟲則未能檢測到，因此推測ace-2可能與線蟲的取食有關。

3.3ACE-3和ACE-4

秀麗小桿線蟲的ace-3和ace-4兩基因均位于染色體Ⅱ，其間有356個核苷由ace-4的終止密碼子和ace-3的起始密碼子分離開來。ACE-3與GPI結構相結合成兩親分子二聚體。ACE-1和ACE-2大約占線蟲總膽堿酯酶活性的95％，ACE-3的活性約占5％。Northern印跡分析發現幾乎檢測不到ace-4 mRNA，但顯示ace-3 mRNA的豐度較高。與電鰩的保守序列FGESAG相比較，秀麗小桿線蟲ACE-3不同的是VGESAG，表明該酶可能具有較低的催化效率。作者發現甘薯莖線蟲的ACE-3中該保守序列并未改變，與電鰩及秀麗小桿線蟲ACE-3的保守序列EDCLY相比較，甘薯莖線蟲的ACE-3該序列改變為ENCLY，即127位天冬氨酸轉變為天冬酰胺(待發表)。秀麗小桿線蟲的ACE-4包含活性位點絲氨酸殘基的保守序列FGQSAG不同于其他ACE的FGESAG，即199位谷氨酸置換成了199位谷氨酰胺。ACE-4可能具有非催化活性功能。

秀麗小桿線蟲的ACE-3不同于其他分子型就在于它對ACh具有較低的K_m，并對抑制劑毒扁豆堿和氨基甲酸酯類殺線蟲劑涕滅威具有高度抗性。這與根結線蟲的ACE-C相類似，對有機磷類和氨基甲酸酯類殺線蟲劑具有相當高的抗性。由于ACE-3在線蟲的咽部肌細胞、頭部神經元、肛門神經節均有表達，這樣對于已建立取食點的線蟲在較高濃度的殺線蟲劑的存在下仍然能取食并持續存活，使得線蟲難以防治。

4、展望

秀麗小桿線蟲基因組的研究促進了線蟲AChE基因的研究，其中包括了線蟲AChE基因的克隆、表達以及結構和功能的研究。線蟲存在多個AChE基因已逐步被人們所認識。但目前國內外對線蟲AChE的研究還較少，對其基因調控、分子進化、發育和生物學意義還不清楚。隨著分子生物學、分子遺傳學和生物信息學等學科的發展，開展對植物寄生線蟲AChE的研究將有助于深入了解線蟲AChE的特性，為開發新的防治藥劑、途徑和方法提供新的理論依據。