ＤｃＥＬＩＳＡ檢測泥鰍、鯽魚中氯霉素殘留方法的應用

摘要：應用直接競爭酶聯免疫吸附試驗方法（dcELISA）快速定量測定泥鰍、鯽魚肌肉中氯霉素（CAP）殘留量。氯霉素濃度在0.05～10ng/g范圍內具有良好的線性關系，線性方程為y=-0.33-1.88x，r2=0.995，向樣品中分別添加0.1、0.3、0.9ng/g三個濃度水平的氯霉素標準品，泥鰍樣品的平均回收率分別為87.2%、88.9%、93.0%，鯽魚樣品的平均回收率分別為86.1%、79.9%、99.0%，最低檢測限為0.05ng/g，批內變異系數為8.0%，批間變異系數為7.2%，結果表明該方法靈敏度高，重復性好，適合在泥鰍、鯽魚肉樣中氯霉素殘留篩選檢測。

關鍵詞：氯霉素殘留；直接競爭酶聯免疫法；泥鰍；鯽魚

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）最初是從委內瑞拉鏈絲菌(Streptomyces Venezuela)的培養液中提取制得，是一類廣譜抗生素。氯霉素對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有明顯的抑制作用，氯霉素由于其優良的抗菌性、穩定的藥性和廉價，曾是我國水產養殖中常用的抗菌藥之一，長期作為飼料添加劑和細菌性疾病的治療用藥[1]。近年來，研究發現氯霉素存在著嚴重的毒副作用，易引發再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥以及新生兒、早產兒灰色綜合癥等[2]。因此，動物性食品中的氯霉素殘留問題一直備受關注，引起國際組織和世界上許多國家和地區的高度重視。中國農業部已將氯霉素從2000年版《中國獸藥典》中刪除列為禁藥，而歐盟的進口食品衛生標準規定“氯霉素含量標準為不得檢出。”[3]

目前，氯霉素殘留分析主要采用氣相色譜法和高效液相色譜法。高效液相色譜法雖然操作簡單，但檢出限較高，無法滿足當前對氯霉素低殘留限量的要求。氣相色譜法靈敏度較高，但樣品前處理過程復雜、分析速度慢、儀器價格昂貴，不適合在基層推廣使用[3-4]。自1984年Campbell等建立檢測CAP的ELISA以來，國外研究進展較快，國內研究相對滯后。隨著ELISA技術的發展直接競爭酶聯免疫吸附試驗法（dcELISA）越來越體現出更多的優勢，基于抗原抗體特異性反應建立起來的dcELISA，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強等諸多優點，可以直接用于生產實踐，適用于大規模氯霉素殘留篩選檢測。

1材料與方法

1.1材料和儀器

Multiskan MK3酶標儀，產地：芬蘭；AL104電子天平，產地：上海；FSH-2可調高速勻漿器，產地：常州；DT5-1離心機，產地：北京；乙酸乙酯、正己烷，分析純，北京化學試劑公司；氯霉素、氯霉素堿、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等標準品，北京獸藥監察所；氯霉素ELISA快速檢測試劑盒，北京中檢維康技術有限公司；生物樣品來源，市售。

1.2樣品的前處理

實驗所采用樣品為泥鰍、鯽魚，分別取肌肉充分剪切、混勻，用高速組織勻漿器破碎，密封袋密封，標記后－20℃保存。

稱取制備的樣品3g置50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振蕩器強烈混合10min；室溫3000g離心10min；取2ml上清液（相當1g樣品）在50℃氮氣流下吹干；用1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入1mlPBS緩沖液振蕩混合10min，室溫3000g離心10min；去上清液（正己烷），取100μl下層水相用于檢測。

1.3抗體交叉反應的測定

抗CAP抗體抑制物分別采用倍比稀釋的氯霉素堿、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考，計算各競爭物的IC₅₀， 比較抗體對它們的親合性。同時，用下式計算各競爭物與抗CAP 抗體的交叉反應。

交叉反應性（%）=IC50（CAP）×100/IC₅₀（競爭物）

1.4分析程序

將所需的的微孔條插入微孔架，每個標準品和樣品做2 個平行，記錄標準品和樣品的位置。加入100μl標準品或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入50μl 稀釋了的抗氯霉素抗體酶標記物于微孔內。充分混合，覆蓋上薄膜，室溫孵育1h。倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打3次，完全除去孔中的液體，每次用250μl洗滌液洗板4次、排干。洗板后加入100μl底物到每個微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15min。加入50μl，2M H₂SO₄終止液終止反應，用酶標儀在450nm處測量吸光度值（OD值）。

1.5標準曲線的制作及樣品濃度的計算

將所獲得的標準品和樣品的OD值按下式折算成百分比吸光度值：

% 吸光度值 = 標準品或樣品的OD值 × 100 / 空白標準品的OD值

以標準樣品濃度為橫坐標，標準樣品的 % 吸光度值為縱坐標，繪制對應氯霉素濃度的半對數校正曲線，樣品濃度根據測得的OD值從校正曲線上讀出。

2結果

2.1標準曲線

按照1.4步驟，分別測定濃度為0、0.05、0.1、0.3、1、3、10ng/ml氯霉素標準液的OD值，采用RIDASCREEN 數據分析軟件建立標準曲線（圖1、圖2），由圖2曲線可知氯霉素濃度在0.05～10ng/ml范圍內呈線性，線性方程為Y = -0.33-1.88X。相關系數：r = 0.997

2.2回收率

向樣品中分別添加3個濃度水平的氯霉素標樣：0.1、0.3、0.9ng/g，每個濃度做4個平行，同時做4個空白樣。按1.2處理后測定氯霉素含量，計算回收率，結果如表1所示。

2.3靈敏度

按照1.4步驟同時測定10個“0”標準溶液的OD值，求出其平均值（X），再減去兩倍標準差（SD），從標準曲線上查出對應于OD值為X－2SD的濃度，即為靈敏度。該方法的平均靈敏度為0.05ng/g。

2.4精密度

采用變異系數表示法，在同一次測定中對3個濃度水平的樣品分別重復測定5次，計算批內變異系數。分別測定3個濃度水平的樣品在3個不同批次測定之間的變異系數，即為批間變異系數。結果如表2所示。

2.5交叉反應

CAP抗體與結構類似物的交叉反應結果見表3

3討論

目前文獻報道的氯霉素的dcELISA針對水產品的檢測的報道較少。本試驗是參照“雞肉和牛奶中氯霉素的提取方法”而建立的水產品中氯霉素提取方法[1-2]，結果表明dcELISA對水產品中氯霉素殘留檢測方法靈敏度高，重復性較好，與間接競爭ELISA（icELISA）相比縮短了檢測時間和操作步驟，減少了操作誤差，更適用于水產品中氯霉素殘留的篩選[6]。與氣相色譜法相比，ELISA方法樣品處理簡單方便，尤其適合大批量的檢測，并且成本低。因此采用dcELISA方法既可減小實驗室的勞動強度，又可節約檢驗費用，在現場監控和基層檢測中有著廣闊的推廣應用前景，是藥物殘留檢測發展的趨勢。本方法在操作過程中應注意的是加入正己烷溶解殘渣再與PBS混合時，劇烈的振蕩，易產生乳化，從而導致分離不徹底。另外，洗板也是本試驗成功與否的關鍵，如果是手工洗板，將洗板次數增加1～2 次，可提高檢測準確度。ELISA方法檢測結果往往會出現假陽性，因此，慎重起見，對檢出的陽性結果還需用氣相色譜法進行進一步驗證。

參考文獻

[1] 魏書林等.雞肌肉組織中氯霉素殘留ELSIA檢測方法的研究[J].中國獸醫雜志，2004，40(9):7-9.

[2] 石德時等.氯霉素間接競爭ELSIA(ciELSIA)檢測方法的建立[J].中國獸醫雜志，2002，22(1):77-79.

[3] Allen E H. Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk，egg and tissues from food producing animal[J]. J Assoc Of Anal Chem，1985，68:990-999.

[4] Wal J M. High performance liquid chromatographic determination of chloramphenicol in mink [J].J Assoc Of Anal Chem，1980，63(5):1044-1048.

[5] 蔣定國等.高效液相色譜法測定牛奶中氯霉素殘留量的研究[J].中國食品衛生雜志，2003，15(1):36-38.

[6] 沈美芳等.用酶聯免疫法測定水產品中氯霉素的殘留量[J].南京師范大學學報，2003，3(2):1-4.