二倍體、三倍體虹鱒的血液指標分析

摘 要：通過對二倍體和三倍體虹鱒紅細胞大小的測量，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在著極其顯著的差異。三倍體虹鱒紅細胞長徑和核長徑分別是二倍體的1.34和1.33倍；紅細胞面積和核面積分別為二倍體的1.43和1.41倍；核體積為二倍體的1.47倍。用MEK-6318血液自動分析儀檢測二倍體和三倍體虹鱒血常規(guī)值，結果顯示：在紅細胞計數(shù)（RBC）和紅細胞平均容量（MCV）上，二、三倍體之間都有著極其顯著的差異。此外，三倍體虹鱒的淋巴細胞、中間細胞和中性粒細胞數(shù)量都顯著超過了二倍體。

關鍵詞：虹鱒；二倍體；三倍體；紅細胞；血液性狀

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬鮭形目（Salmonlformes）、鮭科（Salmonoidei）、大麻哈魚屬（Oncorhynchus），是我國引進的一種常見的冷水性養(yǎng)殖魚類[1]。近年來，由于種質的退化，水霉病的發(fā)病率居高不下。三倍體育種為解決養(yǎng)殖用虹鱒的品質問題提供了一條切實可行的途徑。三倍體由于可育性差，在生殖季節(jié)由于性腺發(fā)育的能量可用于肉質生長，三倍體育種在鯉鯽雜交及虹鱒、團頭魴、羅非魚、牡蠣等水產動物的繁養(yǎng)殖中得到廣泛的應用[2-6]。

三倍體魚類在生長和抗病能力上表現(xiàn)出了特殊的優(yōu)勢。三倍體湘云鯽是由異源四倍體鯉鯽與二倍體的日本白鯽雜交得到的，具有生長快和不育的特點，受到生產者和消費者的青睞，經(jīng)濟效益和社會效益十分顯著[7]。從斑點叉尾鮰的生長速度和性腺發(fā)育狀況來看，三倍體的生長速度較二倍體快，雌性性腺發(fā)育緩滯。三倍體虹鱒在幼魚階段時生長速度稍慢，但性成熟后生長速度超過了二倍體；同時三倍體虹鱒對水霉病和IHN病抵抗力強，且肉質優(yōu)于二倍體虹鱒[8-10]。

魚類三倍體鑒別方法主要有紅細胞大小測量、染色體計數(shù)、DNA含量測定等。測量紅細胞大小能快速直觀地界定不同倍性的魚類個體，同時對魚的存活影響不是很大，是檢測不同倍性魚類的常用方法[10，11]。

根據(jù)北京臥佛山莊養(yǎng)殖有限公司近幾年的養(yǎng)殖經(jīng)驗，虹鱒三倍體抗病力強、生長快、肉質好，深受消費者的歡迎。本文通過測量紅細胞的大小來鑒別二倍體和三倍體虹鱒。應用血液自動分析儀測定血常規(guī)，進行二倍體和三倍體虹鱒的血液性狀的比較，為虹鱒三倍體的育種與養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

試驗魚于2006年9月采自北京臥佛山莊養(yǎng)殖有限公司的虹鱒養(yǎng)殖場。其中二倍體虹鱒是1996年從美國引進的，人工繁殖的3～4代幼魚，三倍體虹鱒是2005年12月從美國北歐瑪養(yǎng)殖科技有限公司購入的發(fā)眼卵，人工孵化的幼魚。試驗魚的尾數(shù)、體長和體重見表1。

1.2血涂片的制備以及紅細胞大小的測量

尾柄部取血，制成血液涂片，經(jīng)甲醇固定后，Giemsa染色15min，在Olympus顯微鏡15×100油鏡下觀察，測量紅細胞及核的長徑、短徑，每尾魚測定10個紅血細胞。以a·b·π/4計算紅細胞的面積以及核的面積，以a2·b/1.91計算紅細胞核的體積，其中a為短徑，b為長徑[11]。求出每個個體紅細胞的平均值和標準差，并進行二、三倍體之間的t-檢驗。

1.3血液常規(guī)參數(shù)的測定

分別取二倍體和三倍體虹鱒各8尾，尾柄部取血約1ml裝入用EDTA浸潤過的1.5ml離心管中，放入裝有冰水的保溫盒內，在北京實驗動物中心用MEK-6138全自動血液分析儀對樣品的11個血液學項目進行測定，依據(jù)血液中粒子體積大小設置紅細胞和白細胞的靈敏度均為2，通過做梯度曲線來確定其閾值，紅細胞和白細胞閾值分別設為5和8。測得的結果除血紅蛋白之外相對穩(wěn)定，其中紅細胞平均容量（MCV）超出了儀器的測定范圍，所以按 “MCV(10-15L)= 10·HCT(%) /RBC(10-15L）”計算得到。對測得的結果進行t-檢驗。

2結果

2.1二倍體與三倍體虹鱒的紅細胞大小測量

二倍體與三倍體虹鱒的紅細胞及核的大小及二者之間的差異顯著性檢驗結果見表2。

由表2可以看出，三倍體虹鱒各項數(shù)值都高于二倍體，二者之間表現(xiàn)出極顯著差異。二倍體與三倍體的長徑之比為1：1.34，其中二倍體個體的紅細胞長徑范圍在14.6～15.3μm之間，而三倍體個體的紅細胞長徑范圍在19.2～20.3μm之間，可以作為判別二倍體和三倍體虹鱒的方法。三倍體虹鱒紅細胞核長徑、紅細胞面積、核面積以及核體積分別為二倍體的1.34、1.43、1.41與1.47倍，差異極顯著（P﹤0.001）。在三倍體的血涂片中有一些紅細胞核有中間斷開的現(xiàn)象（圖1），在測量的時候，沒有選取此類細胞。

2.2二倍體與三倍體虹鱒的血液常規(guī)測定

表3顯示了二倍體和三倍體虹鱒血液常規(guī)測定項目的平均值、標準差以及二者之間的差異顯著性檢驗結果。

由表3可以看出，三倍體虹鱒的RBC明顯低于二倍體，而MCV顯著高于二倍體，均呈極顯著差異；二倍體虹鱒紅細胞比積（HCT）顯著高于三倍體，而紅細胞體積分布寬度（RDW）兩者之間的差異不明顯。

依據(jù)血液白細胞三分類法，血液白細胞可分為淋巴細胞、中間細胞（包括幼稚細胞、噬酸粒細胞、嗜堿粒細胞、大淋巴細胞和單核細胞）和中性粒細胞[12]。虹鱒三倍體的淋巴細胞、中間細胞和中性粒細胞的絕對值都顯著高于二倍體，兩者之間的各絕對值及其百分比均呈顯著差異或極顯著差異。

3討論

對于二倍體虹鱒血液性狀的測定，張桂蘭[13]用常規(guī)血涂片方法對野生與池養(yǎng)1齡和2齡虹鱒血液紅細胞對比發(fā)現(xiàn)：野生、1齡、2齡紅細胞長徑分別為15.1μm、 15.0μm、14.5μm，和本實驗測得的1.49μm相近；紅細胞數(shù)分別為1.02×10¹²/L、0.98×10¹²/L、0.98×10¹²/L，接近本實驗測定值1.1×10¹²/L。錢續(xù)[14]等用全自動細胞分析儀對靬金鱒（是甘肅在上世紀90年代初從虹鱒的變異種中選育而成的新品系[15]）的血液進行分析，結果顯示：靬金鱒的紅細胞總數(shù)為0.3×10¹²/L，顯著地低于野生虹鱒及本研究得到的二倍體虹鱒；靬金鱒的白細胞總數(shù)為69.3×109/L，顯著地高于文中提到的虹鱒，也高于本研究的二倍體虹鱒的結果。錢續(xù)[14] 等認為這種白細胞總數(shù)增高的現(xiàn)象對于生長在我國西部的靬金鱒的抗病能力是有利的。

對于魚類二倍體和三倍體的血液性狀的比較，紅細胞大小因倍性不同而變化。Benfey等[16]對陸封型大西洋鮭二倍體和三倍體的血液學指標進行比較發(fā)現(xiàn)：三倍體大西洋鮭細胞長徑和核長徑分別為：18.3μm和8.4μm，分別為二倍體的1.24和1.26倍，三倍體平均紅細胞面積為二倍體的1.36倍，略低于本實驗測得的結果（1.43倍），而紅細胞核體積為二倍體的1.56倍，比本實驗測得的1.48倍略高。紅細胞數(shù)也會隨著倍性的不同而變化。Benfey等[17]也對二倍體和三倍體虹鱒及美洲紅點鮭對受迫反應的血液學變化作了對比，未受迫的二倍體和三倍體虹鱒的紅細胞數(shù)分別為1.24×10¹²/L和0.73×10¹²/L，倍間差異顯著。二倍體和三倍體美洲紅點鮭的紅細胞數(shù)分別為0.95×10¹²/L和0.68×10¹²/L，低于虹鱒對應值，倍間也存在顯著差異。本實驗測得的二倍體和三倍體的紅細胞數(shù)分別是1.1×10¹²/L和0.7×10¹²/L，接近上述虹鱒測定結果，但高于美洲紅點鮭的對應值。

三倍體大西洋鮭紅細胞平均容量明顯高于二倍體（主要是由于紅細胞長徑的增加造成的，而短徑對其影響很小），而紅細胞數(shù)顯著低于二倍體，使得二者在平均血細胞血紅蛋白濃度上保持一致，以維持兩類魚器官大小和形態(tài)基本保持不變[10]。

虹鱒白細胞中的中性粒細胞和淋巴細胞占有相當?shù)谋壤０准毎闹饕饔檬潜Ｗo機體，抵御病害的侵襲，在機體的免疫反應中起主要作用[18]。白細胞數(shù)量的差別可用于解釋魚類的抗病和在特定環(huán)境下的耐受能力。三倍體虹鱒白細胞中各項值都顯著高于二倍體，可能與三倍體抗病能力強有關。

鯉科魚類隨倍性不同，在紅細胞特性上也會表現(xiàn)出相似的規(guī)律。陶炳春等[19]對鯉魚二倍體和三倍體的紅細胞進行分析，三倍體鯉魚紅細胞的長徑和核長徑分別是二倍體的1.31和1.30倍，紅細胞面積和核面積分別是二倍體的1.54和1.43倍，而紅細胞核體積是二倍體的1.57倍。劉巧[2]等對鯉鯽及其雜交后代不同倍性的魚類的血液學指標進行了對比，得到二倍體、三倍體和四倍體紅細胞數(shù)目隨倍性的升高而降低，紅細胞的體積大小呈現(xiàn)2：3：4的關系。鄒曙明[4]等對團頭魴血液學研究發(fā)現(xiàn)，隨著倍性的增加，紅細胞大小相關的各數(shù)值均顯著增大（P<0.05）；其中，核體積增大最為顯著，團頭魴同源四倍體、倍間三倍體的核體積分別為二倍體的1.97倍和1.39倍。本實驗中三倍體虹鱒的紅細胞面積、核面積與核體積都與二倍體存在顯著差異，但以紅細胞核體積的增加最為明顯，是二倍體的1.48倍。也基本上符合三倍體與二倍體魚類細胞核體積比為3：2的理論比例關系。

參考文獻

[1] 董崇智，李懷明，戰(zhàn)丕榮等.中國淡水冷水性魚類[M]. 哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，2001，26-45.

[2] 劉巧，王躍群，劉少軍等.不同倍性鯽鯉魚血液及血細胞的比較[J].自然科學進展，2004，14(10): 1111-1117.

[3] 龍強，宗虎民.虹鱒魚三倍體的育種技術[J].北京水產，2004，(5):36-37.

[4] 鄒曙明，李思發(fā)，蔡完其等.團頭魴同源四倍體、倍間三倍體與二倍體紅細胞的形態(tài)特征比較[J].中國水產科學， 2006，13(6):891-895.

[5] 馮益民譯.全雌三倍體莫桑比克羅非魚的生產[J] .國外水產，1990，(4): 22-24.

[6] 王昭萍，姜波，孔令峰等.利用四倍體與二倍體雜交規(guī)模化培育全三倍體太平洋牡蠣苗種[J] .中國海洋大學學報，2004，34(5):742-746.

[7] 朱桂華.湘云鯽(白鯽♀×四倍體魚♂)生長的初步研究[J].淡水漁業(yè)，1999，29(9):12-13.

[8] 馬作圻.魚類多倍體及在養(yǎng)殖中應用的可能性[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息，1991，6(4):6-11.

[9] 樓允東.魚類育種學(M).北京：中國農業(yè)出版社，1999，117-152.

[10] Benfey， T. J. and A. M.Sutterlin.The haematology of triploid landlocked Atlantic salmon，Salmo salar L.[J]. J. Fish Biol.，1984，24:333-338.

[11] Lou，Y.D.and C.E.Purdom.Polyploidy induced by hydrostatic pressure in rainbow trout，Salmo gairdneri Richardson[J]. J.Fish Biol.，1984，25:345-351.

[12] 金麗萍.三分類血液分析儀與血涂片鏡檢對白血病患者血液細胞分類結果差異分析[J].北華大學學報，2006，7(4):347-348.

[13] 張桂蘭.虹鱒魚血液學指標的測定[J].鮭鱒漁業(yè)，1991，4(2):80-84.

[14] 錢續(xù)，劉孝玉，敬培石等. 革麗靬金鱒血液學指標的測定[J].河北漁業(yè)，2006，(3):16-18.

[15] 錢續(xù).金鱒形態(tài)學特性的初步研究[J].淡水漁業(yè)，2005，35(5):31-32.

[16] Benfey T.J.， A.M.Sutterlin， R.J.Thompson，.Use of erythrocyte measurements to identify triploid salmonids [J]. Can.J. Fish. Aquat. Sci.，1984，41:980–984.

[17] BenfeyT.J.， B.Michel.， Acute stress response in triploid rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) and brook trout Salvelinus fontinalis)[J]. Aquaculture，2000，184:167–176.

[18] 林浩然.魚類生理學[M].廣州:廣東高等等教育出版社，1999，82-87.

[19] 陶炳春，喬秀亭，董仕.二、三倍體鯉魚血液生理指標的比較研究[J].淡水漁業(yè)，1994，24(4):8-9.