藥物體外肝代謝研究方法

摘 要：對近幾年的文獻資料進行分析、綜合、歸納。介紹肝微粒體體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、離體肝灌流及器官組織切片法。其中，肝細胞體外溫孵法是當今藥物體外肝代謝研究的熱點，對新藥研究與開發及正確指導臨床合并用藥有著巨大的推動作用，將對其進行重點論述。

關鍵詞：體外肝代謝；肝微粒體；肝細胞；離體肝灌流；組織切片

廣義的藥物代謝指藥物在體內吸收、分布、代謝、排泄等一系列過程^［1］。狹義的藥物代謝是指藥物的生物轉化。生物轉化后，藥物的理化性質發生變化，從而引起其藥理和毒理活性的改變。因此，研究藥物的生物轉化，明確其代謝途徑^［2］，對制定合理的臨床用藥方案，劑型設計及新藥開發工作都具有重要的指導意義。當前，國內外對藥物代謝的研究主要集中在代謝產物生成和確定代謝途徑。在分子生物學技術推動下，藥物代謝酶^［3］領域的研究因其對臨床藥物間相互作用的研究有著積極的推動意義，已得到廣泛的重視。

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機體進行生物轉化的主要場所，富含參與藥物代謝的一個龐大的依賴細胞色素P450的混合功能氧化酶系統^［4］，大多數藥物的Ⅰ相反應及Ⅱ相反應都依賴于肝臟酶系統而發生。以肝臟為基礎的體外代謝模型以其特有的優勢在藥物代謝研究中得到廣泛應用，現概述如下。

1 肝微粒體體外溫孵法

肝微粒體法^［5］是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶^［6］，在模擬生理溫度及生理環境條件下進行生化反應的體系，制備肝微粒體一般用差速離心法。

肝微粒體體外溫孵法和其它的體外肝代謝方法相比較，其酶制備技術簡單，代謝過程快，結果重現性好，易大量操作，便于積累代謝樣品供結構研究；同時，該方法可用于對藥酶的抑制及體外代謝清除等方面的研究，因而在實際工作中應用較為普遍。但肝微粒體體外溫孵法同其它體外肝代謝方法相比，在體內情況的一致性方面存在不足，因而其實驗結果用于預測體內情況仍需進一步的確證。

2 肝細胞體外溫孵法

肝細胞體外溫孵法同肝微粒體法相似，即以制備的肝細胞輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環境條件下進行生化反應的體系，適于研究蛋白及mRNA水平藥物代謝酶誘導及酶活性，在評估藥物代謝過程中藥物間的相互作用時，該方法得到廣泛的應用。但肝細胞制備技術較復雜，目前以膠原酶灌注技術為主^［7］，且體外肝細胞活性僅能維持4h，不利于儲存和反復使用。

3 離體肝灌流法

離體肝灌流法與肝微粒體法、肝細胞體外溫孵法相比，一方面保留著完整細胞的天然屏障和營養液的供給，因而能在一段時間內保持肝臟的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有離體系統的優點，能夠排除其它器官組織的干擾，可控制受試物質的濃度，定量地觀察受試物質對肝臟的作用。

Alexandra^［8］等利用離體大鼠肝臟一過式灌流方法研究一種新的抗癌藥BR（苯甲酰胺核糖核苷）的體外代謝，分別以Wistar大鼠與TR2大鼠進行實驗，灌流過程中每隔5min取樣1次，監測BR及其代謝物，結果表明，Wistar大鼠灌流液中只有BR及其去氨基產物BRCOOH通過色譜檢測出來，而BAD（苯甲酰胺腺嘌呤雙核苷酸）未檢出TR2大鼠，灌流液的檢測結果與Wistar大鼠幾乎相同，但在BR與BRCOOH的檢出量上，TR2大鼠組低于Wistar大鼠組18%~23%。同時，應用Wistar大鼠分離肝細胞，對不同濃度的BR（0~3mmol/L）進行了溫孵實驗，通過檢測，BAD仍然無法檢出。通過對BR的離體肝灌流與肝細胞體外溫孵實驗結果比較，均發現BAD低于檢測限，未檢出，這說明BAD這種活性的代謝產物在大鼠肝臟中代謝率很低，BRCOOH為其主要的代謝途徑，故可推測，BR在人體的癌癥治療中，主要代謝生成為BRCOOH。當前，離體肝灌流亦應用于對藥物的藥動學參數進行考察。Christian^［9］等運用該方法考察了藥物CPT~11在膽汁中的排泄、清除速率及AUC等藥動學參數，取得了較好的結果。離體肝灌流法具有器官水平的優勢，兼備體外實驗和整體動物實驗的優點，更適于定量研究藥物體外代謝行為和特點，并能解決在其它的體外肝代謝模型和整體動物實驗中不能得到滿意解決的難點，在藥理學和毒理學的研究中已受到廣泛的重視，但其對實驗設備及技術有一定的要求，一定程度上限制了其應用。

4 器官組織切片法

器官組織切片法也是研究藥物代謝及其毒性的有效的體外系統，該法不破壞器官的細胞構成和組織結構，所得結果與體內法相近。在各種器官組織切片中，以肝切片的應用最多。肝切片相對于純化的P450同工酶、P450混合酶、肝微粒體、游離的肝細胞來說，不僅完整保留了所有肝臟藥酶及各種細胞器的活性，而且保留了細胞間的聯系及一定的細胞間質，更能反映藥物在體內生理情況下的實際代謝過程，且可在較長的孵育時間內保持代謝活性（可達8~24h）；其缺點為切片機的使用受限，而且好的切片機價格昂貴。deKanter^［10］等利用利多卡因、睪酮及7乙氧基香豆素為探針藥物，進行了器官切片溫孵實驗，結果表明，該系統具有Ⅰ相及Ⅱ相多相代謝途徑，且易于比較不同器官組織的代謝差別，研究發現，不同種屬及不同器官間代謝類型及速度不同。

綜上所述，常用的肝體外代謝研究方法有肝微粒體體外溫孵法、肝細胞體外溫孵法、離體肝灌流法^［11］及器官組織切片法等，廣泛應用于藥物的代謝途徑、體內代謝清除及藥物間相互作用的研究，應根據不同的要求和目的選擇應用。體外肝代謝研究可針對先導化合物代謝過快或生成毒性代謝物^［12］的特性進行結構改造，以獲得安全穩定的候選物，根據候選物的代謝特征（如藥酶誘導抑制參與代謝的藥酶種類、活性代謝物的生成等）確定藥物的開發應用價值，因而具有廣闊的應用前景。今后，隨著研究的不斷深入，藥物體外肝代謝^［13］的研究將不斷完善，進一步發揮其價值。

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（責任編輯：杜 靖）