秋水仙素誘變薄皮甜瓜同源四倍體研究

摘要：為了獲得四倍體薄皮甜瓜材料，研究薄皮甜瓜多倍體的特征特性，以二倍體薄皮甜瓜金美為材料，以0.2％、0.4％、0.6％的秋水仙素采用滴苗和浸種2種方法進(jìn)行誘變四倍體試驗，并通過染色體觀察和細(xì)胞學(xué)鑒定對其進(jìn)行倍性分析。結(jié)果表明，滴苗法比浸種法誘變率高，其中以0.4％秋水仙素滴苗誘變率最高，為6.67％；與二倍體相比，四倍體植株子葉和真葉長寬比變小，莖增粗，節(jié)間變短，花冠變大，果肉變厚，種子增寬，可育性降低，中心可溶性固形物含量增高：保衛(wèi)細(xì)胞變大，氣孔密度變小，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目增加；獲得了同源四倍體材料。

關(guān)鍵詞：秋水仙素；薄皮甜瓜；四倍體；誘變

薄皮甜瓜(sp.conomon)屬于二倍體物種，染色體數(shù)目為2n=24。多倍體效應(yīng)能提高植株的抗性，增加果皮、果肉的厚度，而且其耐貯性、可溶性固形物含量等性狀也可獲得改善。鑒于多倍體的效應(yīng)，利用我國薄皮甜瓜資源豐富之優(yōu)勢，通過誘變大量獲得四倍體，可從中選出抗性強(qiáng)、耐貯、品質(zhì)優(yōu)的品種(品系)直接應(yīng)用于生產(chǎn)，擴(kuò)大栽培區(qū)域，或者將其作為中間育種材料，選育三倍體或四倍體雜種一代品種。多倍體甜瓜材料具有生長勢強(qiáng)，抗逆性強(qiáng)，品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)。Lotfi、Sari、Abak、Sauton等對甜瓜單倍體進(jìn)行了加倍研究，并成功獲得雙單倍體；Adel—berg、Rhodes、Ezura、何歡樂、馬國斌等對甜瓜進(jìn)行了離體誘導(dǎo)獲得四倍體的研究；吳明珠等對甜瓜進(jìn)行輻射誘變并獲得多個多倍體甜瓜材料；柴興容、魏育國等采用誘導(dǎo)生長點(diǎn)分裂細(xì)胞染色體加倍，獲得綜合性狀較好的四倍體甜瓜材料；王雙伍等用秋水仙堿進(jìn)行了離體誘導(dǎo)薄皮甜瓜四倍體的研究。但迄今為止，甜瓜多倍體育種工作主要集中于厚皮甜瓜，對薄皮甜瓜的研究較少。本研究以薄皮甜瓜作為材料，通過化學(xué)活體誘導(dǎo)對其進(jìn)行多倍體誘變。詳細(xì)觀察并總結(jié)出薄皮甜瓜經(jīng)不同秋水仙素濃度誘變后的變異規(guī)律，從中得到了有利的變異性狀，為薄皮甜瓜育種提供了新的育種材料。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗于2006年2月至2007年6月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所科研基地進(jìn)行：材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供的薄皮甜瓜品種金美。代號：JMI-1。

1．2 方法

1．2．1 誘變方法 (1)滴苗法：2006年2月24日常規(guī)浸種催芽；2月26日點(diǎn)播于營養(yǎng)杯中：3月8日幼芽2片子葉微張開時，把1小塊脫脂棉放在兩片子葉之間，每天上午8：30-9：30進(jìn)行滴苗處理1次，連續(xù)處理6 d。處理時在棉球上分別滴濃度0.2％、0.4％、0.6％的秋水仙素溶液，直到脫脂棉球浸滿液體，生長點(diǎn)浸在溶液中，但又不下滴。處理期間注意遮陰，以減緩藥液分解速度。處理后去掉脫脂棉球，精心照管，促進(jìn)幼苗生長，幼苗2-3片真葉時移栽大田。每個處理90株。以不做任何處理的植株為對照。(2)浸種法：2006年2月24日，常溫下用0.2％、0.4％、0.6％的秋水仙素溶液浸泡干種子8 h，藥液用量以剛好浸過種子為度，處理后用清水沖洗數(shù)次，將種子置于32-34℃恒溫條件下催芽。種子出芽后，2月27日點(diǎn)播于營養(yǎng)杯，幼苗2-3片真葉時移栽大田。每個處理90粒種子，以清水浸泡種子為對照。

1．2．2 變異觀察鑒定方法 (1)植株形態(tài)觀察初步鑒定：經(jīng)誘導(dǎo)處理的幼苗移栽大田后，根據(jù)植株莖、葉、花、果、種子等形態(tài)變異特征。從誘變?nèi)后w中初選出與四倍體特征相符合的植株。(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：取對照和根據(jù)植株形態(tài)觀察初選具有變異特征植株的新鮮葉片，用鑷子小心撕下葉主脈兩側(cè)的下表皮，然后用碘一碘化鉀染色(碘難溶于水，先將2 g碘化鉀溶于100 mL的蒸餾水中，完全溶解后加入1g碘，震蕩溶解)，染色10-30 min后，在10x40倍顯微鏡下觀察記數(shù)。每個單株隨機(jī)統(tǒng)計10個視野的氣孔數(shù)目和500個保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體的數(shù)目。(3)根尖染色體數(shù)目直接鑒定：經(jīng)器官形態(tài)觀察和細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定篩選的植株自交留種(D1)，每株(單瓜)分別取10粒種子，在32～34℃條件下催芽，待根芽長至1.5 cm左右時，進(jìn)行根尖染色體鑒定。其他步驟參考張永兵等人的根尖染色體鑒定法，

1．2．3 四倍體植株器官形態(tài)特征觀察測定 經(jīng)染色體數(shù)目鑒定為四倍體的自交瓜種子當(dāng)年秋季繼續(xù)種植觀察(D2)，隨機(jī)取3株，觀察測定第10～15片葉子的節(jié)間距、莖粗、葉片長和寬、葉柄長度和粗度：每株分別取3朵當(dāng)天開放的雌、雄花，分別測量花冠長和寬、萼片長、子房縱徑和橫徑；每株取1個自交果實測量果實縱徑和橫徑、果臍大小、果肉厚度、種腔縱徑和橫徑、單瓜正常種子數(shù)和單瓜空秕種子數(shù)、種子長和寬、千粒重及可育率。

1．2．4 其他性狀的比較 (1)中心可溶性固形物含量；隨機(jī)取成熟度一致的四倍體和二倍體甜瓜各3個，用手持測糖儀測定其中心可溶性固形物含量。(2)高滲脅迫下四倍體和二倍體甜瓜種子發(fā)芽率：利用不同濃度(分別為0、3％、5％)的蔗糖溶液進(jìn)行發(fā)芽試驗，發(fā)芽容器為直徑8 cm的玻璃培養(yǎng)，每個處理(加蔗糖溶液)重復(fù)3次，對照(加蒸餾水)重復(fù)2次，每處理10粒種子，加溶液10 mL，然后移入人工智能氣候箱，控制在30℃發(fā)芽。根據(jù)其發(fā)芽勢和發(fā)芽率評價品種苗期對不良外界環(huán)境的抵抗能力。萌芽脅迫指數(shù)=水分脅迫下種子萌發(fā)指數(shù)(PIS)/對照種子萌發(fā)指數(shù)(PIC)；其中萌發(fā)指數(shù)(PI)：(1.00)nd₁+(0.75)nd₂+(0.50)nd₃+(0.25)nd₄，nd₁、nd₂、nd₃，nd₄分別為第1、2、3、4天的種子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2．1 植株形態(tài)觀察及細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)植株器官的形態(tài)變異特征，初選出15株與四倍體相符合的植株。在光學(xué)顯微鏡下觀察對照和變異植株葉片下表皮，發(fā)現(xiàn)15株中有12株的下表皮氣孔保衛(wèi)細(xì)胞與對照相比明顯增大，且其上葉綠體數(shù)明顯增多，而單位視野中氣孔數(shù)目卻明顯減少。

2．2 根尖染色體計數(shù)鑒定

經(jīng)根尖染色體鑒定，12個變異株經(jīng)植株形態(tài)觀察和細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定篩選為四倍體的單株，染色體都從原來的2n=2x=24條變?yōu)?n=4x=48條，證明二倍體甜瓜發(fā)生變異成為同源四倍體。植株器官形態(tài)觀察結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定篩選與染色體直接鑒定的吻合率為100％。

2．3 不同處理誘變同源四倍體甜瓜的效果

試驗結(jié)果表明：滴苗法比浸種法效果好，誘變率高。滴苗法；以0.4％的處理加倍率最高，可達(dá)6.67％，其次是0.6％的處理。浸種法；只有0.4％的處理發(fā)生了誘變，誘變率為2.22％；0.2％處理得到的植株，有的苗期表現(xiàn)出變異特征，但隨著植株的生長，其變異特征逐漸消失；0.6％的處理得到的幼苗出現(xiàn)大量嚴(yán)重畸形，無法生長出正常的根系。無論是采用滴苗法還是浸種法，其植株成活率都隨處理濃度的升高呈下降趨勢，其中以0.2％的處理成活率最高。可見，雖然較高的秋水仙素濃度理論上應(yīng)能獲得較高的變異率，但由于其藥害過重而導(dǎo)致成活率下降，誘變率也因之降低。

2．4 甜瓜同源四倍體與二倍體形態(tài)特征比較

2．4．1 莖葉 四倍體子葉厚而短，呈近圓形，葉色濃綠，葉脈上凸但不明顯：而二倍體子葉薄而長，呈橢圓形，葉色較淡，葉脈較平。四倍體葉色較深，葉片變厚增寬，葉面指數(shù)降低，葉緣呈明顯皺褶。葉柄變短增粗：二倍體葉色較淺，葉片薄而葉面指數(shù)較大，葉柄較長而弱。四倍體植株莖較粗壯，節(jié)間距較短：而二倍體植株莖細(xì)，節(jié)間距較長。這與柴興榮等研究的結(jié)果基本相似。

2．4．2 花器、果實與種子與二倍體相比。四倍體雌花和雄花花冠較大，花瓣皺褶較多且顏色較深。萼片變短，子房變短變粗。二倍體金美的果實為長橢圓形。而誘變成四倍體后果實變?yōu)榻鼒A形或圓形。四倍體甜瓜的果實和種腔與二倍體相比有減小的趨勢，而果肉厚度和果臍大小則有增加的趨勢。與二倍體相比，四倍體種子增大且飽滿，千粒重顯著增加，但單瓜正常種子數(shù)卻明顯降低，僅為原二倍體的20％左右，同時種腔內(nèi)出現(xiàn)了大量空秕籽粒。

2． 其他性狀的變化

2．5．1 中心可溶性固形物含量表5顯示：四倍體甜瓜果實中心可溶性固形物含量比二倍體高。二倍體為13.5％，而四倍體達(dá)15.2％，個別單瓜在16％以上，而且口感很好。由此可見，用秋水仙素誘變多倍體可以作為甜瓜品質(zhì)育種的有效途徑。

2．5．2 高滲條件下四倍體與二倍體甜瓜種子發(fā)芽率和萌芽脅迫指數(shù)高滲條件對四倍體和二倍體甜瓜種子的發(fā)芽率和萌芽脅迫指數(shù)都有一定程度的影響，且隨著蔗糖濃度的增加，四倍體和二倍體甜瓜種子的發(fā)芽率和萌芽脅迫指數(shù)均呈下降趨勢。在3％的蔗糖濃度下，二倍體的發(fā)芽率和萌芽脅迫指數(shù)明顯低于四倍體；在5％的蔗糖濃度下，二倍體的發(fā)芽率和萌芽脅迫指數(shù)分別為22.2％和0.181，明顯低于四倍體的53.3％和0.573％。說明四倍體種子能夠忍受較高的滲透壓，對外界不良環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗能力。

3 討論

3．1 秋水仙素濃度和處理方法對甜瓜四倍體誘變的影響

本研究中隨著秋水仙素濃度的提高，2種處理方法四倍體的誘變率有先上升然后下降的趨勢，但它們之間不是簡單的線性關(guān)系，這與陳勁楓等的研究結(jié)果相似。與浸種法相比，滴苗法的誘變加倍效果較好，其中0.4％的處理效果最佳，誘變加倍率達(dá)6.67％。用0.6％秋水仙素液直接浸泡甜瓜干種子的處理藥害較為嚴(yán)重，造成植株不能正常生長，而且甜瓜幼苗成活率較低，從而降低了甜瓜四倍體的誘變率。所以在甜瓜四倍體誘變試驗中，處理方法和濃度是影響加倍的主要因素。另外，處理時間和誘變率間也有很大關(guān)系，一般來說處理時間短，藥劑濃度低，效果差，誘變率低：處理時間過長，藥劑濃度過高，易發(fā)生藥害，根尖頂端和生長點(diǎn)都會發(fā)生萎縮現(xiàn)象。

試驗中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)溫度也是影響染色體加倍的主要因素。溫度低，植株生長緩慢，細(xì)胞分裂受影響，分裂可能迎合不上藥效作用，從而錯過誘變的最佳時期。如果溫度過高，藥液蒸發(fā)快，誘變效果也不夠理想。另外，因溫度高，藥液蒸發(fā)過快。導(dǎo)致短時間內(nèi)藥液濃度提高造成藥害，從而影響成活率和誘變率。

3．2 四倍體種子的可育性

本試驗四倍體甜瓜單瓜正常種子數(shù)為40-60粒，僅為二倍體的15％左右，明顯低于二倍體，但四倍體甜瓜種子大而飽滿，千粒重也高，為四倍體甜瓜發(fā)芽率和成苗率的提高創(chuàng)造了有利條件。因此四倍體甜瓜在制種及以后的生產(chǎn)利用上既有有利的方面，也有困難的一面，有待進(jìn)一步探索。

3．3 四倍體薄皮甜瓜的利用

3．3．1 四倍體薄皮甜瓜的直接利用 四倍體薄皮甜瓜植株粗壯，葉色較深。葉片厚而大，這些形態(tài)特征為其抵抗外界不良環(huán)境奠定了基礎(chǔ)。四倍體甜瓜果實外形較原二倍體略有減小，但種腔小。肉厚。因此，單果重與二倍體相差不大，尤其經(jīng)株系選擇后，果實大小不但近于原二倍體，而且果個均勻。與原二倍體相比，四倍體果實可溶性固形物含量明顯提高，果肉顯著增厚，從而提高了薄皮甜瓜的商品性。利用豐富的薄皮甜瓜資源，大量誘變四倍體，從中選出抗性增強(qiáng)，果皮增厚變硬，果肉增厚致密，耐貯運(yùn)性增強(qiáng)，從而擴(kuò)大栽培區(qū)域和銷售區(qū)域，達(dá)到直接利用的目的。

3．3．2 四倍體薄皮甜瓜的間接利用 同源四倍體薄皮甜瓜可以作為甜瓜多倍體育種中間材料，經(jīng)常規(guī)人工雜交后可以選育新甜瓜四倍體或者利用2個優(yōu)良四倍體甜瓜組配成雜交一代品種應(yīng)用于生產(chǎn)。它不但可保留原二倍體所不能比及的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀，而且能更突出其多倍體及雜種一代兩大優(yōu)勢效應(yīng)，其抗逆性及抗病性應(yīng)具更突出的效果。

4 結(jié)論

以二倍體薄皮甜瓜金美為材料，以0.2％、0.4％、0.6％的秋水仙素采用滴苗和浸種2種方法進(jìn)行誘變四倍體試驗，結(jié)果表明：(1)采用滴苗法二倍體甜瓜的誘變率明顯高于浸種法，其中用0.4％秋水仙素滴苗誘變率最高，可達(dá)6.67％。(2)薄皮甜瓜經(jīng)秋水仙素處理加倍后，形態(tài)發(fā)生明顯變化，變異株表現(xiàn)為：苗期生長受阻，葉片變厚、顏色深綠，葉形指數(shù)變小，花變大，種腔變小，種子可育性降低。(3)通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定和染色體鑒定，薄皮甜瓜通過有性繁殖的方式獲得了純合的同源四倍體材料。