UPLC-MS/MS 法同時測定小綠葉止咳糖漿中8 種成分的含量

盧薇薇，蘇 丹，彭 秘，劉匡一

（1.江西中醫藥大學第二附屬醫院，江西 南昌 330000； 2.江西中醫藥大學中醫藥防治認知障礙腦疾病江西省重點實驗室，江西 南昌 330000； 3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第908 醫院，江西 南昌 330000；4.南昌市第一醫院藥劑科，江西 南昌 330000）

小綠葉止咳糖漿為德國Engelhard 制藥公司開發的純天然藥物，主要成分是常春藤葉干提取物，用于緩解小兒感冒等各種病因引起的咳嗽，舒緩咽喉腫脹，能有效對抗可能轉化的嚴重支氣管炎癥［1］。前期課題組從小綠葉止咳糖漿中共鑒定出62 種成分［1］，主要為黃酮類、酚酸類、皂苷類，其中皂苷類的常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷，黃酮類的蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷，以及酚酸類的綠原酸等均對呼吸道系統疾病具有一定作用［2-6］。但預實驗發現，秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量太低，傳統的HPLC 法無法滿足其含量測定要求。

UPLC-MS/MS 法作為靈敏度較高的檢測方法，適用于含量低、成分復雜的樣品檢測。因此，本實驗采用該方法同時測定小綠葉止咳糖漿中常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸的含量，以期為該制劑質量評價提供參考，也為其后期藥動學、藥效物質基礎研究提供數據支撐。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜系統（日本島津公司）； AB SCIEX 5500 三重四級桿質譜儀（美國AB SCIEX 公司）； TC-16G 高速離心機（上海安亭科學儀器廠）； VORTEX-6 渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； AL104 分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； DCY-24S 恒溫氮氣吹干儀（青島?？苾x器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸對照品（批號110753-201415，純度≥96.2%） 購于中國食品藥品檢定研究院； 蘆?。ㄅ朆20771）、常春藤皂苷C （批號B20163）、常春藤皂苷B （批號B20166）、α-常春藤皂苷 （ 批號 B21958）、秦皮甲素 （ 批號B20989）、金絲桃苷（批號B20631）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號B21133） 對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98.0%。小綠葉止咳糖漿 （德國 Engelhard 公司，批號 19F059A、19L051A、20D095A、21N069A） 購于網絡購物平臺天貓國際自營店。甲醇、乙腈為色譜純，均購于美國Thermo Fisher 公司； 甲酸為質譜純，購于美國Sigma 公司； 水為蒸餾水，購于廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 取100 μL 藥液，置于10 mL 量瓶中，加50% 乙腈至刻度，超聲處理30 min，50%乙腈補足減失的質量，取適量，0.22 μm微孔濾膜過濾，16 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2 對照品溶液制備 取常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸對照品適量，80%乙腈溶解稀釋，制成質量濃度分別為1 169、181、159、118、152、150、192.5、142 μg/mL 的溶液，即得，4 ℃下冷藏保存。

2.3 陰性樣品溶液制備 按說明書添加工藝，制成缺常春藤提取物的純糖漿空白制劑，按“2.1”項下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相0.05%甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～1.5 min，5% B；1.5～5 min，5% ～40%B； 5～10 min，40% ～90%B；10 ～11 min，90% B； 11 ～11.1 min，90% ～5% B；11.1～12 min，5%B）［7-13］； 體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃； 進樣量1 μL。

2.5 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負離子掃描； 正離子電壓5 500 V，負離子電壓-4 500 V；Gas 1/Gas 2 50 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； Cur Gas3 5 psi，其他參數見表1。

表1 各成分質譜參數Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗 圖1 ～3 顯示，各成分色譜峰峰形理想，空白無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 陰性樣品多反應監測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of negative samples

圖2 對照品多反應監測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms of reference substances

圖3 供試品多反應監測色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of test samples

2.6.2 線性關系考察 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液適量，乙腈稀釋成不同質量濃度，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，并分別以S/N ＝10、3 為定量限、檢測限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.3 精密度試驗 取“2.2” 項下對照品溶液適量，選擇中間質量濃度，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定7 次，測得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸峰面積RSD 分別為 2.31%、2.17%、2.28%、3.58%、2.03%、3.01%、2.85%、2.76%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩定性試驗 取“2.1” 項下供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.4”“2.5” 項條件下進樣測定，測得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸峰面積RSD 分別為 2.79%、3.22%、2.67%、3.88%、2.56%、3.42%、3.06%、2.98%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.6.5 重復性試驗 取“2.1” 項下供試品溶液適量，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定7 次，測得常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸峰面積RSD 分別為2.33%、2.16%、2.54%、3.15%、3.52%、3.11%、2.92%、2.73%，表明該方法重復性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗 取藥液 （批號21N069A） 50 μL，加入常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸質量濃度分別為1.67、1.81、1.59、1.18、1.52、1.50、1.93、1.42 μg/mL 的“2.2” 項下對照品溶液100、200、500 μL，按“2.1” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定，計算回收率。結果，常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸平均加樣回收率分別為98.11%、96.72%、99.48%、100.13%、101.28%、96.61%、98.12%、98.54%，RSD 分別為2.19%、3.42%、3.67%、2.48%、2.11%、1.78%、3.82%、2.66%。

2.6.7 樣品含量測定 取3 批樣品，按“2.1”項下方法平行制備3 份供試品溶液，在 “2.4”“2.5” 項條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（μg/mL，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （μg/mL，n＝3）

3 討論與結論

在色譜柱方面，課題組前期定性研究時采用T3 柱，目的是將小綠葉止咳糖漿中極性偏大或偏中性的成分更好地進行分離。本實驗所測成分大多為極性偏小的黃酮類和皂苷類，故最終選擇C18色譜柱。

在流動相方面，本實驗通過正負離子同時掃描的方式進行數據采集，水相考察了0.1%、0.05%甲酸，綜合化合物響應情況，最終選擇0.05% 甲酸-乙腈體系。

MRM 圖顯示，3.01 min 為綠原酸出峰時間，2.33、3.41 min 出現相應峰信號。根據前期定性分析數據，可知存在新綠原酸、隱綠原酸同分異構體，通過二級確證，推測2.33 min 處為新綠原酸，3.41 min 處為隱綠原酸，根據參考文獻［14-20］結構相似定量報道，以綠原酸為對照品對兩者進行含量測定，結果分別為19.64、4.80 μg/mL。

本實驗首次建立UPLC-MS/MS 方法同時測定小綠葉止咳糖漿中常春藤皂苷C、常春藤皂苷B、α-常春藤皂苷、蘆丁、秦皮甲素、金絲桃苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、綠原酸的含量，該方法專屬性強，靈敏度高，分析時間短，可為該制劑質量標準研究提供參考，并能為其后期藥動學、藥效物質基礎研究提供數據支撐，從而為相關臨床合理用藥奠定基礎。