ｅＮＯＳ在大鼠正畸牙周組織中的早期介導作用

[摘要]目的：觀察大鼠正畸牙齒移動過程中上皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase ，eNOS）在牙周組織內的表達分布，從而探討一氧化氮（nitric oxcide，NO）及eNOS在正畸牙齒移動中的意義。方法：建立大鼠正畸實驗動物模型，取其受力牙及牙周組織做免疫組化切片。結果：eNOS隨牙齒移動時間的不同其表達分布發生變化，在加力第一天牽張側的eNOS表達明顯增強。結論：NO及eNOS在正畸牙齒移動中發揮作用，eNOS在牙齒移動的早期起了重要的介導作用。

[關鍵詞]一氧化氮合酶；一氧化氮；免疫組化；牙齒移動

[中圖分類號]R783[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2008)03-03

The early effection of endothelial nitric oxide synthase in rat's periodontal tissues during orthodontic tooth movement

PEI Xiu-jie1，LIN Gui-shu2，QI Yan-yun1

(1.Department of Orthodontics，The First Hospital in the City of Qinhuangdao，Qinhuangdao 066000，Hebei，China;2.Department of Orthodontics，The Third Affiliated Hospital of Hebei Medical University)

Abstract:Objective To observe the distribution and the changes of endothelial nitric oxide synthase(eNOS) in periodontal tissues.To evaluate the putative role of nitric oxide(NO) and endothelial nitric oxide synthase(eNOS) in orthodontic tooth movement. MethodsApplied force on the left first maxillary molars in rats and examined the decalcified alveolodental connected tissues in different stages of tooth movement with immunohistochemical staining technique (SP method).ResultseNOS exists in normal periodontal tissues.The expression of eNOS changesduring orthodontic tooth movement.ConclusionNO and eNOS plays animportant role in remodeling of periodontal tissues during orthodontic tooth movement. eNOSreacts actively earlier.

Key words:nitric oxide synthase;nitric oxide;immunohistochemistry;tooth movement

有關一氧化氮(nitric oxide，NO)及一氧化氮合酶( nitric oxide synthase，NOS)在口腔醫學中作用的研究自1993年Bodis首次在唾液中檢測到一氧化氮開始便如火如荼。而關于其在口腔正畸學中作用的研究目前在國內鮮有報道。本實驗通過建立大鼠的正畸實驗動物模型，對其受力牙及牙周組織進行免疫組化染色，觀察上皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）在牙周組織內的表達分布，從而探討NO及eNOS在正畸牙齒移動中的作用及意義。

1材料和方法

1.1實驗材料：雌性SD大鼠（sprague -dawley rats）25只（由河北醫科大學實驗動物中心提供）14周齡，體重（240+20）g，標準飼料，自由飲水，分籠，適應性喂養一周后實驗。主要試劑：北京中山生物有限公司生產的eNOS免疫組化試劑盒。

1.2方法

1.2.1實驗分組：將實驗動物隨機分為加力0、1、3、7、14天組，每組5只。

1.2.2正畸實驗：將實驗動物按照50mg/Kg行戊巴比妥那麻醉，然后在大鼠的左側上頜第一磨牙及左側上頜切牙的牙頸部用細金剛砂車針打磨出一“C”形固位溝，將兩牙間用結扎絲和鎳鈦拉簧連接，牽引力為60g。

1.2.3標本制作：將大鼠按組分別行4％多聚甲醛心包灌注致死，然后取其受力側的第一磨牙及其周圍牙槽骨組織放入4％多聚甲醛中4℃固定24h，10％EDTA常規脫鈣、包埋、制作石蠟切片，切片厚度為3μm，然后行HE及免疫組化染色。

2結果

加力0D偶見破骨細胞及個別血管上皮細胞有少量eNOS表達；加力1D牽張側血管內皮細胞、破骨細胞、部分成纖維細胞eNOS表達增多；加力3D破骨細胞、成纖維細胞、成骨細胞、血管內皮細胞均呈強陽性高表達；加力7D各種細胞表達強度均有所減弱；加力14D破骨細胞數量減少，表達進一步減弱，少量間質細胞、成骨細胞有弱表達。采用樣本間兩兩比較秩和檢驗統計結果顯示各組陽性表達面積不同或不完全相同，加力0D組與加力1D組，加力0D組與加力3D組的表達面積存在差異，結果有統計學意義（P<0.01）。（如圖1～3，表1～2）

3討論

一氧化氮合酶至少有3種同工酶在不同的組織細胞中存在，它們是神經元型(nNOS)，上皮型(eNOS)及誘生型(iNOS)。其中神經元型與上皮型統稱為原生型(cNOS)，原生型一氧化氮合酶通常為鈣離子依賴型，正常時cNOS處于無活性靜止狀態，Ca2+由細胞外內流達一定程度使CaM結合，cNOS即被激活，數分鐘內引起NO釋放。許多研究表明NO有雙向性，這種雙向性與其生成的多少有關，正常量的NO在組織的正常生理中發揮作用，起組織保護作用，而NO生成量不足或過量均可造成細胞組織或器官的相應病理損害。

牙周膜內環境的穩定性是正畸牙齒移動的生物學基礎之一。Warita的實驗證明正常咬合力作用下的牙周組織中存在一定量的一氧化氮合酶，而沒有咬合力作用的牙周組織中一氧化氮合酶的活性會下降，認為NO在牙周組織功能及形態的維持上起著重要作用[1-2]。Kikuiri等將牙周膜細胞接種于具有彈性底部的培養皿內，然后周期性施力，發現經過刺激的細胞所產生的NO代謝產物NO2/NO3的含量3倍于未接受刺激的細胞組，同時免疫組化檢測證明在接受刺激的條件下成纖維細胞內eNOS的表達有所增強，說明在受力反應中NO的釋放主要由eNOS催化產生[3]。Buss R等認為eNOS的激活是由于血流速度的改變導致血管內皮細胞NOS活性變化[4]。國內錢令嘉的實驗驗證了這一說法，他們在離體的血管內皮細胞表面施加流動剪切力揭示血管內皮細胞中NOS可以敏感的接受血流速度改變的信號，繼而產生一系列生理病理效應[5]。Fox等曾用NOS抑制劑L-NMMA試圖在機械力的作用過程中干擾骨組織形成，發現如果在施力前注射L-NMMA會影響網狀骨的形成，而在施力后再應用L-NMMA則作用消失，認為cNOS在機械刺激的早期骨組織形成中發揮著重要的作用[6]。

本次實驗結果顯示在加力的過程中，eNOS在牙周組織中隨受力時間的長短而變化，說明NO參與了正畸過程牙周組織的改建。在加力的第1天受力牙的牽張側，eNOS的活性顯著增強，這個結果與Kikuri的實驗一致。說明在受力的早期eNOS起了重要的介導作用，而且早期激活的eNOS存在于擴張的血管周圍，提示早期的機械牽張力一方面直接作用于牙周膜細胞激活牙周膜細胞內的eNOS，另一方面作用于血管內皮細胞使得血管內皮細胞中eNOS活性增強，這樣局部的NO濃度適度的升高使得牙周膜內環境穩定，血管張力平衡得以保持。有實驗表明牙周纖維細胞所受牽張力使之發生細胞形變，當細胞形變達到細胞體的2.8％時就會使細胞內Ca2+的濃度發生改變，也許這是機械力作用早期使得原生型NOS被激活的原因。

總之，NO及eNOS在正畸牙齒移動牙周組織改建過程中起了重要的介導作用，研究它的作用機理對于研究加速正畸牙齒移動速度，及抑制牙齒移動中病理性的骨吸收等具有重要的臨床實用意義，對其進一步的研究還需要更多的實驗。

[參考文獻]

[1]Warita H， Watarai H， Soma K. Nitric oxide synthase expression is increased by occlusal force in rat periodontal ligament[J].Orthod Craniofac Res，2004，7(2):122-126.

[2]Watarai H， Warita H， Soma K. Effect of nitric oxide on the recovery of the hypofunctional periodontal ligament[J].J Dent Res，2004，83(4):338-342.

[3]Kikuiri T， Hasegawa T， Yoshimura Y， et al. Cyclic tension force activates nitric oxide production in cultured humanperiodontal ligament cells[J]. J Periodontol， 2000， 71(4):533-539.

[4]Buss R，Fleming I. Rgulation and functional consequences of endothelial nitric oxide formation[J]. AnnMed，1995，27:331.

[5]錢令嘉.剪切應力對血管內皮細胞一氧化氮合成酶活性的影響及其機理探討[J].中國應用生理學雜志， 1999，15(4)：342-345.

[6]Fox SW， Chambers TJ， Chow JW. Nitric oxide is an early mediator of the increase in bone formation by mechanical stimulation[J].Am J Physiol， 1996， 270:E955-960.

[收稿日期]2007-01-23 [修回日期]2007-12-10

編輯/何志斌

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”