３Ｙ－ＴＺＰ全瓷材料體外細胞毒性試驗（ＭＴＴ法）

[摘要]目的：初步評價牙科全瓷材料3Y-TZP生物相容性。方法：根據ISO標準采用體外細胞毒實驗（MTT法）測試不同濃度和浸提時間的材料浸提液L-929小鼠結締組織成纖維細胞的影響從而對全瓷材料3Y-TZP的生物相容性進行初篩。結果：各濃度組OD值均與陰性對照無顯著性差異（P>0.05），與陽性組差異顯著 (P<0.01)，材料毒性級別0級。結論：兩種材料體外細胞毒實驗陰性，初步認為材料具有較好的生物相容性。

[關鍵詞]3Y-TZP；生物相容性；體外細胞毒實驗

[中圖分類號]R783[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）03-03

Preliminary evaluation on biocompatibility ofall-ceramic dental material:3Y-TZP

LI Guo-hua1，GONG Zhen-yu1，YU Shu-xiang2，CHEN Ji-hua3

(1.Department of Stomatology， Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command， Fuzhou 350025，Fujian，China)

Abstract: Objective To preliminarily evaluate the biocompatibility of 3Y-TZP which were used as a new dental all-ceramic materials. Methods According to ISO standards， in vitro cytotoxicity-test (MTT method) on L-929 cell were carried on. Results The OD-value of each test group were similar to the negative control and significantly different from positive control which indicated that the materials tested were safe to L-929 cells. Conclusion It is preliminarily estimated that 3Y-TZP is a safe material for dental clinical application.

Key words：3Y-TZP;biocompatibility;vitro cytotoxicity-test(MTT method)

隨著人們對審美要求的不斷提高，越來越多的修復專業人士及患者樂于接受色澤逼真，無齦緣灰線的全瓷修復體。以往的全瓷材料因脆性大使其臨床應用尤其是后牙橋、多單位長橋受到限制，氧化鋯具有應力誘發相變增韌性能而被稱為韌性陶瓷，是最有希望替代金屬烤瓷的全瓷材料[1-2]。目前國內外的此類產品研究方興未艾。良好的生物相容性是生物材料包含牙科材料得以應用的重要前提，也是保證臨床安全的重要技術指標。因此針對這種材料的生物學評價是十分必要和重要的。本研究采用體外細胞毒性試驗的方法檢測該材料對細胞生長狀況的影響，從而初步評價其生物相容性。

1材料和方法

1.1實驗材料：3mol%氧化釔穩定的四方多晶氧化鋯（3Y-TZP）全瓷材料試件；受試細胞株：小鼠結締組織成纖維細胞（L-929細胞），ISO推薦；主要試劑與設備：①MTT：全稱為3-（4，5-二甲基噻唑基-2）-2，5二苯基四氮唑溴鹽（Sigma，USA）；實驗前用PBS（0.01mol/L，pH值7.4）新鮮配制，0.22μm微孔濾菌器過濾除菌；②DMSO（西安化學試劑廠）：全稱為二甲基亞砜；③DMEM培養液，10%小牛血清；④BioRAD Model-550酶聯免疫酶標儀；⑤Heraus二氧化碳孵箱；⑥Olympus IX-70倒置相差顯微鏡。

1.2實驗方法

1.2.1陶瓷材料浸漬液的制備：將實驗材料所作試件打磨圓鈍后，無水乙醇超聲清洗20min，干燥后在121℃，33MPa壓力下滅菌處理后放入無菌培養皿，加入10mlDMEM培養液（表面積與浸提液之比為1.5cm2/ml）后置于37℃培養箱中浸泡24h，制成浸提液。完成后用DMEM培養液分別稀釋，制備100%、50%、25%、12.5%的浸提液，放入4℃冰箱保存。

1.2.2凍存L-929細胞復蘇后經過兩次傳代，生長情況穩定。取對數生長期的受試細胞系，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度約1 000個/ml，接種細胞于96孔培養板（200μl/孔，n=4）置于5%CO2、37℃培養箱中，在飽和濕度條件下培養24h。

1.2.3準備4塊96孔培養板，分別用于連續培養1、2、4、8天組。每塊培養板按照陰性對照，4個不同濃度的實驗組，陽性對照，空白對照組（調零）劃區分組，每組樣本5孔。

1.2.4觀察細胞貼壁良好后，棄去原培養液，按照實驗分組分別將當日要用的不同濃度的材料浸提液按10%的濃度加入小牛血清，后加入各實驗組（200μl/孔），陰性對照為DMEM培養液，加入血清的培養液，單純浸提液。陽性對照為0.1%苯酚，常規培養。

1.2.5 MTT檢測：分別培養1、2、4、8天（其中4天與8天組需要隔3天換液一次），終止培養前4h加入0.5%MTT（20μl/孔），繼續培養4h，加入DMSO150μl置于室溫下15～20min，震蕩培養板10min使染色均勻，采用酶聯檢測儀在490nm波長測定各孔光吸收值（OD值），計算出各組的均值。

1.2.6采用倒置相差顯微鏡，觀察細胞形態，于MTT檢測前對細胞照相。

1.2.7評價方法：計算出每種材料的陰性對照和各濃度組的OD均值（n=4）。以陰性對照的OD值作為100%細胞增殖率，則各濃度組的細胞增殖百分率可依式P%=各濃度組OD均值/陰性對照組OD均值×100%求出，將浸提液各濃度組的P%轉化為0～5級細胞毒性：

2結果（見表1～4，圖1～4）

培養同樣的培養時間各濃度實驗組的OD值之間沒有明顯的差異（P＞0.05）；隨培養時間延長，各濃度組OD值都逐漸增高，不同濃度的各實驗組與陰性對照組之間無顯著性差異（P＞0.05）；各實驗組均與陽性對照組有顯著差異（P＜0.01）。可以認為實驗材料細胞毒性分級與陰性對照同為0級，陽性對照毒級為5級。根據細胞增殖曲線可見：各濃度實驗組的細胞增殖曲線都與陰性對照組走勢相似，與陽性對照組差別明顯。

圖2～4分別為MTT檢測前陰性對照組8天、100％濃度的實驗組培養8天及陽性對照組培養1天細胞的照片。可見實驗組細胞形態良好，為長梭形和多角形，并可見圓形分裂細胞，表明細胞生長旺盛，細胞折光性強，與陰性對照組相似。陽性對照組正常細胞形態消失，核固縮或溶解，漂浮在培養液中。染色后，實驗組MTT結晶物密度與陰性對照組相似，呈現為透明的藍紫色，陽性組染色后變色不明顯。

3討論

為了檢測牙科材料的生物相容性，細胞毒性實驗常常是材料初選時的必測項目[3]。本實驗采用間接接觸方法，通過細胞的增殖率來測定細胞的生長增殖情況，從而間接檢測材料對細胞的毒性作用。在正常培養基中，L-929細胞通過有絲分裂呈指數增長，當有外來因素影響其生長時，則會出現細胞粘附力、細胞生物合成活性及細胞增殖率的下降，嚴重時可導致細胞死亡[4]。本實驗基于此原理，通過材料對細胞增殖率的影響大小，來判定材料的體外細胞毒性程度。

MTT法的原理是生活細胞線粒體上的琥珀酸脫氫酶可與外源性的MTT發生氧化還原反應，被還原成不溶于水的藍紫色結晶物沉積于細胞內，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的紫色結晶物，然后酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值，就可以間接反應活細胞的數量[5]。目前國際上在評價一種細胞毒性實驗方法時，往往把該方法的生物學終點和其證實過程放在首位，即看該方法最終測定的是細胞哪個方面的生物學變化。如觀察細胞的形態學變化，細胞核計數及測定細胞的酶活性改變等。MTT試驗法的生物學終點是重要的細胞器-線粒體，線粒體在細胞的生命活動中是一個能量供應站，其數目在細胞生命活動旺盛時增多，衰退時則減少。線粒體病變被認為是表示細胞受損傷最靈敏的指征。MTT試驗法用線粒體作為其生物學終點，可以十分靈敏地反映出被測試材料對細胞造成的毒性損害程度。

MTT試驗法具有通用性，廣泛用于各種器械材料的評價。通常可以根據生活細胞的數量，細胞的形態學觀察，死亡分解的細胞數量和彌散范圍等方面來衡量，將細胞增殖度法與細胞的形態學觀察相結合，可以更加有效地評價材料的細胞毒性。細胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關[6]，本實驗為此設計了不同濃度的浸提液比較，其統計結果無顯著性差異，也從側面說明本實驗材料對細胞沒有毒性。

4結論

從毒性評級比較，本實驗所檢測的3Y-TZP全瓷材料的毒級為0級，可認為對細胞無毒，即該材料屬于惰性材料，不會干擾生物細胞的正常功能，可以初步認為該材料對人體是安全的。

[參考文獻]

[1]李國華，陳吉華.粉體粒度對全瓷材料3Y-TZP力學性能與顯微結構的影響[J].中國美容醫學，2007，16（1）：91-95.

[2]上海生物材料研究測試中心譯，國際標準化組織7406技術報告.牙科材料的生物學評價[J].口腔材料器械雜志，1995；4(1)：41-46.

[3]Stanley HR. Biological evaluation of dental materials[J].Int Dent J，1992，42(1):37-46.

[4]Mollnes TE. Biocompatibility: complement as mediator of tissue damage and as indicator of incompatibility[J]. Exp Clin Immunogenet，1997，14(1):24-29.

[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.

[6]Meryon SD.The influence of surface area on the in vitro cyto－toxicity of a range of dental materials[J].J Biomed Mat Res，1987，21:1179-1186.

[收稿日期]2007-12-17[修回日期]2008-01-31

編輯/何志斌