葡萄籽提取物原花青素對皮膚急性光損傷Ｆａｓ蛋白及Ｂｃｌ－２蛋白表達的影響

[摘要]目的：評估外用葡萄籽提取物原花青素對急性光損傷的Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達的影響。方法：實驗設計正常皮膚組、單純2MED照射組、基質＋2MED照射組、含葡萄籽提取物原花青素樣品外用＋2MED照射組共四組，連續3天同樣處理24h后對皮膚取材，進行Fas蛋白及Bcl-2蛋白免疫組化染色。結果：含葡萄籽提取物原花青素樣品外用＋2MED照射組的Fas蛋白表達積分與單純2MED照射比較明顯下降，Bcl-2蛋白表達積分明顯增加，接近正常皮膚。結論：葡萄籽提取物原花青素對日曬傷具有一定的防護作用，其機制可能是與Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達相關。

[關鍵詞]葡萄籽提取物原花青素；光損傷；Fas 蛋白， Bcl-2蛋白

[中圖分類號]R758.14Q591.2[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-03

Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on protein expression from acute ultraviolet injury

YUAN Xiao-ying1，LIU Wei1，XIE Yan-fei，GUO Guang-jin1，MENG Ru-song1，FAN Li-ying1，ZHANG Jie1，TIAN Yan1，MA Hui-min1，XIN Xu-ya1

(1. Department of Dermatology， the Air Force General Hospital of PLA， Beijing 100036，China; 2. Department of Dermatology， the Otorhinolaryngology Hospital of Baitou， Baitou 062510， Hebei，China)

Abstract:ObjectiveIn this study， the Influence of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Fas Protein and Bcl-2 protein expression from acute ultraviolet injury was investigated in skin by solar-simulator radiation. MethodsAreas of skin of normal volunteers were divided into four sites: normal untreated skin， skin treated with 2-MED UV radiation， or skin treated with GPSE solutions or Vehicle 30minutes before 2-MED solar simulated radiation. Skin areas of different sites were examined immunohistochemically for Fas Protein and Bcl-2 protein expression.ResultsOn immunohistochemical examination， Skin treated with GSPE before UV radiation reduced Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression compared with skin treated only with UV radiation.ConclusionGrape Seed Proanthocyanidin Extract may protect skin against acute sunburn partly through reducing Fas protein expression and upregulated Bcl-2 protein expression.

Key words: Grape Seed Proanthocyanidin Extract， sunburn， Fas ， Bcl-2

隨著生活水平的提高，人們進行越來越多的戶外運動、日光浴，導致接受過多的紫外線照射。研究表明皮膚在急性紫外光損傷過程中，大量氧自由基生成、細胞內鈣超載、大量炎性細胞浸潤以及線粒體損傷等均可促使皮膚DNA損傷，從而導致角質形成細胞調亡。在細胞調亡過程中，調亡相關的蛋白表達產物Fas蛋白及抗凋亡因子Bcl-2蛋白的作用被認為有重要意義。大量實驗表明葡萄籽提取物原花青素（Grape Seed Proanthocyanidin Extract，GSPE）是一種強效抗氧化劑，但對于其是否對光損傷所造成的細胞調亡的影響并不清楚。本實驗研究葡萄籽提取物原花青素對皮膚急性光損傷Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達的影響。

1材料和方法

1.1 實驗材料與儀器：日光模擬器GS-2000 (中國計量科學研究院生產)，包括一個450瓦的氙燈加上一個WG320濾光片（Schott， Clichy， France），光線輸出模擬連續的290 至 400nm 的日光紫外線輸出。Fas和Bcl-2單克隆抗體(編號為MAB－0226)、二抗均為美國Maxim公司產品，購自福州邁新生物技術公司。GSPE購自深圳建安公司，純度為95％，將8克GSPE溶于100ml的50％的乙醇溶液（即基質），制成樣品。

1.2 實驗對象：實驗招募10名志愿者，所有志愿者身體健康，沒有接受任何醫學治療，既往沒有皮膚病史、日光過敏史。所有的志愿者在試驗結束后均獲得一定的經濟補償。這項實驗由空軍總醫院倫理委員會批準。

1.3 實驗設計：志愿者需要5次就診。第一天按25％六孔遞增法在每位健康志愿者的臀部測定其初始最小紅斑量（minimal erythema dose，MED）值。

第二天讀取最小紅斑量的數值，其中出現邊界清楚的紅斑所需要的能量即為最小紅斑量。在志愿者的背部分別測定為7cm×3cm大小的四處皮膚并做相應標記，分別作為Group1(G1)、Group2(G2)、Group3(G3)、Group4(G4)，其中G1組不作任何處理；G2組連續三天單純接受2倍MED0值日光模擬照射；G3組先外用基質處理，30min后接受2倍MED值日光模擬照射，連續3天均同樣處理；G4組先外用含GSPE的樣品，30min后接受2倍MED值日光模擬照射，連續三天。樣品和基質的涂抹量為2μl/cm2。

第五天即最后一次照射24h后在四個標記部位的中心分別用3mm孔徑的環鉆鉆取皮膚，用福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片于4度冰箱保存備用。

1.4 Fas基因和Bcl-2基因蛋白表達檢測：取上述石蠟標本相應部位的連續切片各5張，采用鏈霉素－生物素－過氧化物酶技術法進行免疫組化染色和AEC顯色法。簡單的說，石蠟切片經二甲苯和梯度酒精脫水，用PBS沖洗三次，每次5min。3%過氧化氫酶阻斷以消除非特異性著色，室溫下孵育10min。加特異性第一抗體后放置4℃冰箱過夜，用PBS洗滌三次，每次5min。鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶在室溫下孵育10min，用PBS洗滌三次，每次5min，AEC室溫8～20min顯色，然后用自來水沖洗，蘇木素復染，中性封片劑封片。參照Bresalier法[1]，在每張切片上隨機觀察10個高倍視野，根據每個視野中細胞的染色特征進行計分，未著色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。取其平均值作為整張切片的染色強度評分。

1.5統計學處理：采用SPSS軟件進行統計學分析，組間均數比較采用q檢驗進行，P＜0.05為差異有顯著性。

2結果

皮膚組織中Fas基因和Bcl-2基因的蛋白表達

2.1G1組僅可見極少數散在的Fas蛋白陽性染色細胞；G2組和G3組可見較多的Fas蛋白陽性染色細胞；G4組Fas蛋白陽性染色細胞明顯減少。

2.2G1組可見較強的的Bcl-2蛋白陽性染色；G2組和G3組可見Bcl-2蛋白陽性染色明顯減弱；G4組Bcl-2蛋白陽性染色細胞較前增多，與G1組Bcl-2蛋白陽性染色細胞數目近似。

具體結果圖1、圖2和表1。

3討論

短期較強的紫外線照射通常導致皮膚急性光損傷，可明顯增加皮膚組織中活性氧自由基的生成，產生過多的氧自由基與細胞內的結構相互作用而造成細胞DNA的損傷，皮膚角質形成細胞出現凋亡。Fas蛋白是存在于細胞表面的一種膜蛋白，為Fas基因的產物，是一種凋亡細胞受體，其活化后可導致細胞在數小時內凋亡[2]，在啟動急性光損傷所致的角質形成細胞凋亡中被認為具有極其重要的意義。Bcl-2基因被稱為“存活基因”，由Bcl-2基因編碼的Bcl-2蛋白位于核膜、粗面內質網和線粒體膜上[3]，Carson[4]發現Bcl-2蛋白能調節細胞穩態及抑制線粒體中細胞色素C的釋放等作用，阻斷引起凋亡的最后共同通路，有阻止細胞凋亡的能力。本實驗發現，接受2MED紫外線照射后，Fas蛋白表達積分明顯升高，而Bcl-2蛋白表達積分明顯減少，說明在日曬后皮膚損傷的早期就可能出現了凋亡。

近年來天然抗氧化植物在光損傷及光防護、治療上受到國內外廣泛的關注[5-7]。研究發現一些植物如綠茶、大豆、海藻及部分果實提取物如石榴等抗氧化物質能夠對紫外線引起的光損傷引起的角質形成細胞凋亡具有較好的防護及治療作用。以往研究同樣證明，GSPE具有強效的抗氧化作用，在其抗氧化能力是維生素C及維生素E的數十倍[8]，有研究表明GSPE能夠對心肌灌注損傷的Fas基因表達上調，Bcl-2基因表達下調，但尚無紫外光損傷方面的實驗。本研究結果顯示，外用GSPE后再接受2MED紫外線照射的皮膚與單純接受2MED紫外線照射的皮膚對比，皮膚中Fas蛋白表達積分顯著減少，而Bcl-2蛋白表達積分顯著增加，在一定程度上說明了GSPE對急性光損傷所致的角質形成細胞凋亡具有防護作用，但是GSPE是否單純通過此條途徑抑制凋亡，尚有待進一步研究。

[參考文獻]

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[收稿日期]2007-12-18[修回日期]2008-03-04

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”