ＳＫＩ基因多態性與中國華東地區部分人群非綜合征性唇腭裂的相關研究

[摘要]目的：探討SKI基因257C＞G多態與中國華東地區部分人群非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)發生的關系。方法：采用病例對照設計，應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP），進行SKI基因257C＞G多態性檢測，并進行遺傳統計分析。結果：對于SKI基因257C＞G，8個雜合子父母及患兒的核心家庭TDT 檢驗(χ2=3.56，P＞0.05)；50例NSCL/P 患兒和50例正常兒童基因型及等位基因頻數病例對照研究(χ2= 2.08，P＞0.05)。 結論：SKI基因257C＞G位點多態與中國華東地區部分人群NSCL/P 的發生無相關性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。

[關鍵詞]非綜合征性唇腭裂；基因多態性；SKI基因

[中圖分類號]R782.2[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-03

Relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate and genetic polymorphisms of SKI

GAO Xia， LIU Jia-yin，CUI Yu-gui，ZHOU Xiao-ping， WAN Wei-dong

(Department of Plastic Surgery，Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University， Nanjing 210009，Jiangsu，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) and genetic polymorphism of SKI in Chinese population. MethodsCase-control study design was employed. SKI genotypes were determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism t echniques ( PCR－RFLP).ResultsAs to SKI 257C>G， 8 heterozygous parents with an affected child were analyzed through case-parental control study using TDT (χ2= 3.56， P>0.05) . The genotype frequency and allele frequency of 50 NSCL/P cases and 50 controls were analyzed through case-control study (χ2= 2.08， P>0. 05).ConclusionThe genetic polymorphism of SKI 257C＞G is not associated with the development of NSCL/P， and the genetic polymorphism of SKI is not a risk factor for NSCL/P in the Chinese population.

Key words: nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate;genetic polymorphism;SKI

非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P) 是指不伴發其他系統器官畸形的不在綜合征之內的唇裂、唇裂合并腭裂或單純腭裂的總稱。NSCL/P 發病原因仍不明確。目前研究認為是一種多基因易感性疾病，環境及遺傳因素共同作用引起發病[1-2]。文獻報道與NSCL/P 相關的基因達20余個。SKI基因是其中之一。但SKI基因與NSCL/P 畸形發生的相關研究國內外報道極少。為探討中國人群SKI基因多態性與NSCL/P 發生的關系，我們應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）對50例NSCL/P患者SKI基因257C＞G多態位點進行了遺傳研究分析。

1資料和方法

1.1 臨床資料：選自50個核心家庭，共50 例患兒，均為東南大學附屬中大醫院整形外科住院手術的唇腭裂畸形患者，其中唇裂15例，唇裂合并腭裂35例，并排除了其他系統畸形或綜合征之內的唇腭裂病例。對照組50例兒童均為南京市兒童醫院“上感”就診患者，排除了綜合征或非綜合征性唇腭裂畸形。兩組兒童均來自中國江蘇和安徽地區，均為漢族，年齡，性別分布也無差異。

1.2基因多態性檢測

1.2.1 樣本采集：抽取患兒及父母，對照兒童外周靜脈血2ml，EDTA 抗凝。

1.2.2 DNA 提取：按PUREGENE DNA 純化試劑盒的說明書 （美國GENTRA公司）抽提外周血白細胞基因組DNA。

1.2.3 PCR 擴增：擴增引物由上海英駿生物公司合成，引物序列為 F5′-AGA AGA CGC TGG AGC AGT TC-3′R 5′-GGT CGG ACG GCA TGA AGA AG-3′。SKI基因257C＞G反應體系：總反應體系50μl，其中上下游引物各2μl(10 pmolPμl)，2×Pfu PCR Master Mix 25μl ，ddH2O 13μl ，模板DNA 2μl(100μgPμl)，DMSO 6μl.PCR 反應條件：94℃變性3min，PCR循環條件為94℃30 min、58℃30min、72℃2min，共30個循環，最后72 ℃延伸5min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色檢測PCR 擴增結果(圖1) 。

1.2.4 擴增產物PCR-RFLP分析：限制性內切酶Ehe I酶切消化SKI基因257C＞G PCR擴增產物，共30μl，其中PCR 擴增產物20μl，10×Buffer Tango 2μl，nuclease free Water 7μl，Ehe Ⅰ酶1μl，37 ℃酶解5h。4%瓊脂糖凝膠電泳。分析記錄基因型（圖2）。

1.3 統計分析：配對資料的McNemer 檢驗，計算傳遞失衡指數(transmitted disequillibrium test，TDT)；NSCL/P患兒與正常兒童基因型構成及等位基因頻數的比較。

2結果

2.1 SKI基因擴增結果和基因型分析：SKI基因257C＞G擴增目的片段為234bp，EheⅠ酶切后，257C＞G野生型產生2個片段，長度為101，133bp；C →G 后失去一個酶切位點，因此，純和突變型257C＞G 產生1 個片段，長度為234bp，雜合突變型257C＞G 產生3個片段，長度為234，101，133bp。

2.2 計算傳遞失衡指數(TDT)：以患兒染色體等位基因為病例，以父母未傳遞給患兒的一對等位基因為對照，進行1∶1 配對的病例對照研究。TDT(χ2)=3.56，P＞0.05.

2.3 NSCL/P 患兒與正常兒童基因型及等位基因頻數的比較分別記錄患兒和正常對照兒童的SKI基因257C＞G基因型，進一步計算等位基因頻數，各組間比較，SKI基因257C＞G的 χ2=2.08，P>0.05。差異無統計學意義（表2）。

3討論

非綜合征性唇腭裂是一種常見的先天性顏面部缺陷，其發病率因國家、地區、種族的不同而有所不同，從1/500到1/2500[3]不等，其中亞洲和美洲人群發病率最高，歐洲人群居中，非洲人群最低。在中國，NSCL/P是一種常見的先天畸形，在頭面部先天畸形中位居首位。該畸形的出現影響患兒正常的生理、心理發育，給患兒的父母帶來沉重的心理和經濟負擔。目前，該病的發病原因尚處于研究階段。現在認為，非綜合征性唇腭裂是一種多基因易感性疾病。而SKI基因正是眾多易感基因中的一種。

1986年，Stavnezer E等[4]從感染了禽白血病轉化缺陷病毒Bratislava 77的雞胚胎細胞分離出來的一組逆轉錄病毒－SKV病毒。通過溶解和點雜交發現眾多的SKV病毒中包含了一段共同序列，既是v-SKI。SKI基因位于人類1q22-1q24，是一種原癌基因，屬于myc家族。SKI基因編碼核內DNA結合蛋白，可通過調節或誘導其它與面部結構形成有關的因子的轉錄作用，間接控制面部畸形的產生。Colmenares C.等[5]認為SKI通過調節兩組因子的轉錄來控制唇腭裂的發生。第一組是Rara/Rarg（視黃素受體家族基因）和TGF（轉化生長因子）。第二組是MSX2 和BMP4。這兩組基因都已被證明和唇腭裂的發生有一定的相關性。SKI基因雖然在顱頜面結構的形成起重要作用，但該基因的缺失或突變，是否導致NSCL/P畸形發生的相關研究國內外報道極少。

我們對中國江蘇和安徽地區50例NSCL/P 核心家庭計算傳遞失衡指數(TDT) ，結果顯示SKI 基因257C＞G 在50例NSCL/P 核心家庭中不存在遺傳失衡現象。對50 例患兒與50例正常兒童SKI 基因257C＞G的基因型及等位基因頻數進行比較表明， SKI 基因257C＞G兩個等位基因頻率在兩組人群中分布也無明顯差異。上述結果提示，SKI基因257C＞G位點多態可能與中國華東地區部分人群NSCL/P無明顯相關性。2005年，Wei Lu等[6]對394位非綜合征型唇腭裂病例進行SKI基因257C＞G多態性分析，結果顯示SKI基因257C＞G可以降低NSCL/P的發生風險。這些結果充分說明NSCL/P 的發生原因是非常復雜的。許多研究都已表明，NSCL/P具有多基因遺傳的特點，而且與環境因素以及遺傳與環境的相互作用有很大的關系[7]。就本次研究而言，SKI基因257C＞G位點多態與中國華東地區部分人群NSCL/P 的發生無相關性，可能不是NSCL/P的主要易感基因。

[參考文獻]

[1]Prescott NJ，Winter RM，Malcolm S.Nonsyndromic cleft lip and palate: complex genetics and environmental effects[J].Ann Hum Genet，2001，65:505-515.

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[3]Wyszynski DF， Diehl SR. Infant C677T mutation in MTHFR，maternal periconceptional vitamin use， and risk of nonsyndromic cleft lip[J].Am J Med Genet，2000，92:79-80.

[4]Li Y， Turck CM，Stavnezer E.Unique sequence， SKI， in Sloan-Kettering avian retroviruses with properties of a new cell-derived oncogene[J]. J Virol，1986，57(3):1065-1072.

[5]Colmenares C， Heilstedt HA，ShaVer LG， et al. Loss of the SKI proto-oncogene inindividuals affected with 1p36 deletion syndrome is predicted by strain-dependent defects in SKI－/－mice[J]. Nat Genet，2002，30:106-109.

[6]Wei Lu，Kelly Volcik.Genetic variation in the proto-oncogene SKI and risk for orofacial clefting[J].Molecular Genetics and Metabolism，2005，86:412-416.

[7]Christensen K，Olsen J，Norgaard-Pedersen B，et al.Oralcleft，transforming growth factor alpha gene variants， and maternal smoking:a population-based case-control study in Denmark，1991-1994[J].Am J Epidemiol，1999，149:248-255.

[收稿日期]2007-11-29[修回日期]2008-02-28

編輯/張惠娟