ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ分子在瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞中的變化

[摘要]目的：探討瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）HLA-DR和HLA-DQ分子的含量及其基因型的變化。方法：采用免疫細胞化學方法檢測10例瘢痕疙瘩患者、10例扁平瘢痕患者及10例正常人外周血單個核細胞中HLA-DR、HLA-DQ分子的含量；應用聚合酶鏈反應-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）方法檢測60例瘢痕疙瘩患者和110例正常人外周血單個核細胞HLA-DR和HLA-DQ的基因位點。結果：①瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞HLA-DR、HLA-DQ分子含量的變化：瘢痕疙瘩組HLA-DR+、HLA-DQ+細胞的積分光密度（813.16±62.77，420.12±94.25）高于扁平瘢痕組（636.22±133.95，302.77±89.77）和正常人組（597.88±166.36，308.57±44.05）（P＜0.01）；②瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞中HLA-DR和HLA-DQ基因位點的變化：瘢痕疙瘩組HLA-DR14和HLA-DQ5位點的抗原頻率（0.16，0.28）明顯高于對照組（0.06，0.15）（P＜0.05），HLA-DR17和HLA-DQ8位點的抗原頻率（0.02，0.03）明顯低于對照組（0.13，0.15）（P＜0.05）。結論：HLA-DR和HLA-DQ分子含量在瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞中增高提示瘢痕疙瘩患者機體可能處于高免疫應答狀態；基因型檢測結果則提示HLA-DR14、HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因，HLA-DR17、HLA-DQ8可能是抵抗基因。

[關鍵字]瘢痕疙瘩；HLA-DR；HLA-DQ

[中圖分類號]R619+.9[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-04

Variation of HLA-DR、DQ molecule in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients

SUN Dong-jie， CHEN Dong-ming， NIE Fang-fei， LI Sheng， ZHAO Xia， BAO Wei-han

(Department of Plastic Surgery， the Third Hospital of Peking University， Beijing 100083， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the variation of contents and genotypes of HLA-DR、DQ molecules in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients. MethodsThe expression levels and distribution patterns of HLA-DR、DQ in peripheral blood mononuclear cells were determined in 10 samples of keloid， 10 samples of thin and flat scar and 10 cases of normal people with immunocytochemical staining. The gene locuses of HLA-DR、DQ in peripheral blood mononuclear cells of 60 patients with keloid and 110 normal persons were detected by using polymerase chain reaction-sequence specific primers（PCR-SSP）.Results①The variation of the HLA-DR、DQ molecules contents in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients: The integrated absorbance of HLA-DR+、HLA-DQ+ cells in the keloid group（813.16±62.77，420.12±94.25）was higher respectively than that of HLA-DR+、HLA-DQ+ cells in the flat scar（636.22±133.95，302.77±89.77） and normal people groups （597.88±166.36，308.57±44.05）（P＜0.01）. ②The variation of gene locuses of HLA-DR、DQ in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients: HLA-DR14 and HLA-DQ5 antigen frequencies were significantly higher in patients with keloid（0.16，0.28） than those in the controls（0.06，0.15）（P<0.05）， while HLA-DR17 and HLA-DQ8 antigen frequencies were significantly lower in patients with keloid（0.02，0.03） than those in the controls（0.13，0.15）（P<0.05）.ConclusionThe contents increase of HLA-DR、DQ molecules in the peripheral blood mononuclear cells of keloid patients suggests that the organism of keloid patients may have strong immune reactions; The result of genotyping suggests that HLA-DR14 and HLA-DQ5 may be the predisposing genes of keloid while HLA-DR17 and HLA-DQ8 may be the counteracting genes of keloid.

Key words: Keloid;HLA-DR;HLA-DQ

皮膚瘢痕疙瘩的發生是多因素作用的結果，其中免疫因素起著至關重要的作用[1-2]。HLA-II類分子包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，主要分布于B細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、內皮細胞和活化的T細胞表面，負責呈遞外源性抗原，是免疫應答反應的關鍵分子[3]。本實驗采用免疫細胞化學方法分析瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞中HLA-DR與HLA-DQ蛋白含量和分布；采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物技術（PCR-SSP）檢測瘢痕疙瘩患者外周血單個核細胞中HLA-DR、HLA-DQ基因位點的改變，以探討HLA-DR、HLA-DQ在瘢痕疙瘩發病機理中的作用。

1材料和方法

1.1 材料來源：實驗所用血液標本均來自北京大學第三醫院成形外科瘢痕門診。采用瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常人外周血各10例用于HLA-DR、HLA-DQ蛋白檢測；60例瘢痕疙瘩及110例正常人的外周血用于HLA-DR、HLA-DQ的基因檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫細胞化學方法：外周血單個核細胞涂片的制備：取新鮮外周血，肝素抗凝，用RPMI-1640培養液稀釋后，采用密度梯度離心法提取單個核細胞，離心涂片機涂片，直徑0.8cm，丙酮固定，-20℃貯存備用。

免疫細胞化學染色：選用鏈霉卵白素-過氧化物酶法顯示HLA-DR，HLA-DQ蛋白。I抗，鼠抗人HLA-DR、HLA-DQ單克隆抗體及HistostainTM -SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術公司購置，DAB顯色。

1.2.2 序列特異性引物多聚酶鏈式反應（PCR-SSP）方法：基因組DNA的提取[4]：取靜脈血5ml，EDTA抗凝，用鹽析法提取DNA，測定吸光度值，調整DNA濃度至50～100ng/μl。

序列特異性引物多聚酶鏈式反應（PCR-SSP）[5]：Biotest DRB SSP kit（德國）、DQB SSP kit（德國）PCR反應板（德國）內含有32個反應孔，第一孔為陰性對照孔，不含特異性引物，其他31孔含有特異性引物，可檢測31個基因位點，31對特異性引物已由公司預先放入反應孔中。基因片段均為120～270bp。PCR反應體系：50μlPCR反應緩沖液（10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2），含4種200μmol的dNTP，一對引物各為1μmol/L，1μg待擴增DNA，混合后94℃5min預變性加入Taq酶、模板DNA。PCR反應條件：94℃4min預變性，94℃10s變性，退火65℃1min，延伸72℃1min為一個循環進行擴增，共35個循環，后延伸72℃5min。

結果判定：擴增產物于2%瓊脂糖凝膠中（含溴化乙錠1μg/ml）電泳后，紫外透射燈下觀察結果，相應的HLA-DR、HLA-DQ等位基因電泳道中可見到清晰的DNA條帶即為陽性。

1.3統計分析

1.3.1 免疫細胞化學結果統計分析：HLA-DR+、HLA-DQ+細胞的計數方法：在10×40倍光鏡下，選取細胞分布均勻的區域記200個單個核細胞，分析各組陽性細胞百分率。

HLA-DR+、HLA-DQ+ 細胞的積分光密度：應用CMIAS2001B多功能彩色圖像分析儀，在10×20倍數下采集圖像，每張樣本選取5個視野，檢測瘢痕疙瘩組、扁平瘢痕組和對照組外周血HLA-DR+、HLA-DQ+單個核細胞的積分光密度。積分光密度是各個單獨探測的像點密度分布的總和，即積分光密度=被測物體面積×平均光密度。用積分光密度表示HLA-DR、HLA-DQ分子的蛋白含量，P＜0.05為有顯著性差異。

采用SPSS11.0統計軟件進行數據處理，細胞計數和積分光密度的數據均以x±s表示，所得計量資料多組間比較行單因素方差分析，兩兩比較用LSD方法，P＜0.05為差異有顯著性意義。

1.3.2HLA-DR、HLA-DQ基因型分析方法：瘢痕疙瘩組及正常對照組HLA-DR、HLA-DQ各基因位點的抗原頻率（antigen frequency，Af）=陽性例數/檢測例數，基因頻率（gene frequency，Gf）=1- ；計算相對危險率（relative risk，RR），RR=瘢痕疙瘩組抗原頻率/對照組抗原頻率，RR＞1表示該基因位點瘢痕疙瘩組的抗原頻率高于對照組，即有此基因的人患該病的危險性增高，RR<1則反之，RR=1表示該位點與疾病無關聯，最后經χ2檢驗分析其易感性基因位點， P＜ 0.05為有顯著性差異。

2結果

2.1 瘢痕疙瘩、扁平瘢痕和正常人外周血HLA-DR+及HLA-DQ+單個核細胞的比較：Wright-Giesa染色，光學顯微鏡下觀察離心涂片，可見單個核細胞包括淋巴細胞，核大圓形，一側有切跡，呈藍紫色，胞質少，呈天藍色；單核細胞較大，核為橢圓形或腎形，呈淺紫色，胞質灰藍色；偶見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等細胞（圖1）。

免疫細胞化學染色，鏡下可見HLA-DR陽性和HLA-DQ陽性信號均在單個核細胞表面，著棕黃色，無棕黃色的為陰性細胞（圖2）。

圖1 正常人外周血單個核細胞（Wright-Giesa染色，400×）(單個核細胞包括淋巴細胞（a），核大圓形，一側有切跡，呈藍紫色，胞質少，呈天藍色。單核細胞（b）較大，核為橢圓形或腎形，呈淺紫色，胞質灰藍色)

瘢痕疙瘩組、扁平瘢痕組和正常對照組3組HLA-DR+單個核細胞數量分別為（62.82±13.0）、（59.85±13.75）和（61.05±16.37）；HLA-DQ+單個核細胞數量分別為（21.90±8.86）、（29.20±8.85）和（21.10±8.16）。統計學分析組間比較（P＞0.05）差異無顯著性意義。而瘢痕疙瘩組HLA-DR+、-DQ+單個核細胞的積分光密度均高于扁平瘢痕組和正常對照組(P＜0.01)（表1）。

2.2 瘢痕疙瘩和正常人外周血HLA-DR及HLA-DQ基因型的比較：PCR-SSP結果顯示正常人及瘢痕疙瘩患者HLA-DR、HLA-DQ基因分布在23個基因位點（表2），通過相對危險率（RR）評估瘢痕疙瘩與HLA-DR，-DQ基因位點的關聯，結果RR＞1的基因位點包括HLA-DR1、11、13、14、15、51和DQ5、6；RR＜1的基因位點包括HLA-DR4、9、10、12、16、17、52、53和DQ2、7、8、9；RR≈1的包括HLA-DR7、8和HLA-DQ4。 經χ2檢驗，瘢痕疙瘩組與對照組相比HLA-DR14及HLA-DQ5的抗原頻率（0.16，0.28）明顯高于對照組（0.06，0.15）（P＜0.05），其RR值分別為2.62和1.83；HLA-DR17和HLA-DQ8的抗原頻率（0.02，0.03）明顯低于對照組（0.13，0.15）（P＜0.05），RR值分別為0.13和0.23。

3討論

HLA-DR 和HLA-DQ 屬HLA-Ⅱ類抗原， 編碼它的基因群稱為人類主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC） 位于第6 號染色體的短臂上，是目前已知的人體最具多態性的基因體系[3]。HLA-Ⅱ類抗原存在于抗原提呈細胞、B 淋巴細胞、單核細胞，負責外源性抗原的加工和提呈，對CD4＋T細胞具有限制作用，通過抗原肽-MHC-T細胞受體三分子復合體形式參與免疫應答[6]。樹突狀細胞是一種抗原呈遞細胞，HLA-DR＋樹突狀細胞在瘢痕疙瘩組織中的增加說明瘢痕疙瘩局部處于高免疫應答狀態[7-8]。與扁平瘢痕組和正常對照組相比，瘢痕疙瘩患者外周血HLA-DR＋、HLA-DQ＋單個核細胞數量雖無明顯差異但HLA-DR、HLA-DQ含量增多，此結果表明，瘢痕疙瘩患者機體可能也處于一種高免疫應答狀態，當有某些因素刺激時易發生機體免疫應答反應。該結果可能解釋臨床上常說的“瘢痕體質”，即在同樣部位、同樣致傷因素作用下，大部分人能正常愈合，而少部分人形成瘢痕疙瘩的現象。

早在1977年Laurentaci 等人報道白種人增生性瘢痕與HLA-B14 和HLA-Bw16 相關開始[9]，陸續有研究發現HLA-B21、-Bw35、-DR5、-DQw3 、HLA-DQ5和A血型與瘢痕疙瘩的發生有較密切的關系[10]。本實驗通過PCR-SSP 方法觀察發現瘢痕疙瘩的發生與HLA-DQ5及HLA-DR14呈正相關，與HLA-DR17及HLA-DQ8呈負相關。HLA-DR14、-DQ5、-DR17 和HLA-DQ8 基因位點可能是瘢痕疙瘩患者易感的單倍型。其中HLA-DR14和HLA-DQ5可能是瘢痕疙瘩的易感基因，而HLA-DR17和HLA-DQ8則可能是其抵抗基因。

與本研究比較，前期研究[11]結果顯示HLA-DR14位點的相對危險率在所有基因位點中最高（2.98），但經χ2檢驗無顯著性差異(P＞0.05)。排除計算方法問題，本實驗增加了樣本量，統計分析可見DR14位點相對危險率雖稍有降低（2.62），但經過χ2檢驗P＜0.05，差異顯著。該結果說明HLA-DR14在瘢痕疙瘩發生過程中可能是一個參考的單倍型基因。

[參考文獻]

[1]Santucei M， Borgognoni L.Keloid and hypertrophic scars of caucasians show distinctive morphologic and immunophentypic profiles[J]. Virchows Arch，2001，438 (5) :457-463.

[2]劉德伍.瘢痕的發病機制和治療進展[J]. 中國美容醫學，2003，12(2):217-220.

[3]Suun Yoon Choo.The HLA System: Genetics， Immunology， Clinical Testing， and Clinical Implications[J]. Yousei Medical J，2007，48(1):11-23.

[4]Miller SA，Dykes DD，Polesky HF，et al. A simple salting-out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J]. Nucleic Acids Res，1988，16 (3) :1215-1218.

[5]王振雷，何路軍，張 颯， 等. 人類白細胞抗原分型技術的進展[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(37):7457-7460.

[6]Van den Elsen PJ， Rudensky A. Antigen processing and recognition recent developments[J]. Curr Opin Immunol，2004， 16: 63-66.

[7]陳東明，王琦，鮑衛漢，等.樹突狀細胞在異常瘢痕中的免疫調控作用[J].中華整形外科雜志，2001， 17(5): 282-284.

[8]楊會強，李小靜，孟剛，等. 瘢痕疙瘩的形成與Langerhans細胞的相關性研究[J]. 安徽醫科大學學報，2006，41(5):513-515.

[9]Laurentaci G， Dioguardi D.HLA antigens in keloids and hypertrophic scars[J]. Arch Dermat，1977，113(12) :1726-1729.

[10]Berman B， Bieley H. Keloid[J]. J Am Acad Dermatol，1995， 33(1):117-123.

[11]陳東明， 李生， 鮑衛漢.瘢痕疙瘩與HLA-II 類基因相關性研究[J]. 解剖學，2004，27(6):589-591.

[收稿日期]2007-12-26[修回日期]2008-03-05

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”