基因沉默技術的研究動態及在畜牧業中的應用

摘要：從RNA干擾現象的發現、篩選及基因沉默的發生開始，概述了細胞水平基因沉默的效應，并由細胞水平上過渡到模型動物試驗階段，在此基礎上，著手家畜基因沉默的研究，最后，涉及到基因沉默技術在畜牧業上的應用前景。

關鍵詞：基因；沉默；RNA干擾；畜牧

中圖分類號：Q75；Q342

文獻標識碼：A

文章編號：1007-273x(2008)06-0016-02

基因沉默是雙鏈核糖核酸(RNA)介導的特異性轉錄后的基因失活現象，其本質是RNA干擾(RNA interference，RNAi)，它是當前生命科學中的熱點領域。2001年和2002年RNAi研究連續兩年入選美國《科學》雜志評定的年度自然科學十大突破。目前，RNA干擾技術已成為基因功能研究的有力工具，并在人類疾病模型、基因治療、新藥研發以及畜牧遺傳育種等諸多領域展示了誘人的應用前景。

RNAi技術在相對低等的真核生物中，比如錐蟲、線蟲和果蠅等，應用最為廣泛深入，尤其在線蟲，已經實現了全基因組水平的大規模、高通量的基因沉默研究，成為線蟲遺傳學的基礎研究工具和應用平臺。比較而言，RNAi在哺乳動物上的進展則曲折得多。早期研究發現，向哺乳動物體內導人dsRNA，引發強烈的干擾素反應，導致體內信使RNA(mR-NA)的非特異性降解，全面抑制所有蛋白的合成。這從根本上限制了RNAi在哺乳動物中的應用。幸運的是，新研究發現導入的雙鏈小RNA(dsRNA)小于30堿基(bp)時，既能特異性沉默內源基因，又可逃避干擾素反應通路，而當引入dsRNA長度為21bp時，基因沉默效應最為有效。這使得RNAi的研究進入了哺乳動物時代。

1、細胞水平上的基因沉默

哺乳動物中最初的RNAi研究是在細胞水平進行的。即針對靶基因，設計并體外合成21bp的雙鏈小干擾RNA(siRNA)，轉染體外培養的細胞，然后觀察細胞代謝及表型的異常，從而確定靶基因的功能。此方法有兩大弊端，一是dsRNA的合成費用非常昂貴；二是由于哺乳動物缺乏siRNA的內源擴增機制，因此基因沉默效應是暫時性的，一旦導入的dsRNA耗盡，基因沉默效應也就隨之消失。2002年Brummel Kamp等模擬和借鑒RNAi的機制，發明了一種siRNA表達載體。該發現一方面規避了昂貴的dsRNA合成，使RNAi實驗變得更加經濟，實現了siRNA的持續表達，極大的拓寬了RNAi的應用范圍。同年，Hasuwa等以及McCaffrev等應用siRNA干擾載體，成功獲得了RNAi小鼠，在動物個體水平上實現了基因沉默，證明了RNA干擾技術用于轉基因動物研究的可行性。這一進展具有重大意義。一方面，它標志著一種新的轉基因動物制備方法的誕生；另一方面，與傳統基因敲除小鼠的制備相比，應用RNAi制備轉基因動物則無論經濟還是技術上都有很大的優勢。尤其RNAi動物表現的基因沉默效應在表型上與相應基因敲除動物具有一致性。最近，siRNA干擾載體的設計又有了新的進展，Kasim等人將loxP序列插入siRNA載體的環狀結構區，利用Cre-loxP重組系統實現了siRNA的誘導性表達，另外的一些學者將能夠被強力霉素或蛻皮素激活的特殊轉錄因子與RNA聚合酶Ⅲ啟動子整和在一起，構建了可誘導的siRNA表達載體，使人們能夠按意愿控制siRNA的表達與否，將基于載體的RNAi提高到了一個新的水平，也使得條件型基因沉默小鼠的構建成為可能。

2、小動物上的基因沉默

基因沉默小鼠的成功制備，證明RNAi技術能夠在動物個體水平上實現基因沉默。就研究基因功能而言，基因沉默小鼠在很大程度上可以取代傳統基因敲除技術，而就技術路線和遺傳效應而言，基因沉默小鼠還具有傳統基因敲除所無法具備的獨特優勢。第一，從技術角度考慮，制備基因敲除個體涉及打靶載體構建、ES細胞培養、同源重組、生殖系嵌合體制備等多項高難度的關鍵技術環節；而基因沉默小鼠利用新興的RNAi技術制造特定基因的失活，技術新、步驟少、實驗周期短、技術難度小、成本低。第二，從遺傳學角度考慮，傳統基因敲除一般只能失活個體兩個等位基因中的一個，相當于隱性突變，往往需進一步繁育生成突變純合鼠才能觀察到表型效應：而基因沉默通過靶mRNA的抑制和降解制造功能缺失，相當于顯性突變，因此可以省略傳代純合步驟，直接在雜合子中觀察靶基因功能缺失的表型效應，從而顯著加快實驗進程。因此，基因沉默技術有望成為適應后基因組時代需求的、新型的、經濟快捷的哺乳動物個體水平基因功能研究平臺，基因沉默小鼠制備技術的研究和提高意義重大。

基因沉默小鼠技術體系主要包括基因沉默載體的構建、轉基因動物制備及基因沉默效應的評估3個主要技術環節，其中以siRNA干擾載體的設計和構建最為關鍵。目前應用最廣泛的干擾載體是基于莖環發夾結構的干擾載體，早期研究認為莖部長度為21bp的發夾結構與細胞內源的siRNA結構最為相近，基因沉默效應也最高，最近卻有研究發現，莖部長度為27bp或29bp時，引發的基因沉默效應可能顯著增加，甚至百倍于傳統的21bp莖環結構。小鼠基因沉默技術目前存在的主要問題有兩個：第一，人們目前對21bp、27bp及29bp發夾沉默效應相對優劣的理解都只是基于細胞水平的研究，缺乏動物個體水平的驗證；第二，人們對siRNA干擾載體在基因沉默小鼠中的整合位點、拷貝數，以及在不同組織中的表達情況和沉默效應，以及可能產生的副效應的認識幾乎空白，缺乏基礎性的數據和資料。通過建立小鼠基因沉默技術體系，為小鼠個體水平的RNAi研究提供基礎性數據和資料，為家畜個體水平的基因功能研究提供有力的技術平臺，也將為基因沉默技術在豬育種中的未來應用打下基礎，同時添補基因沉默數據和資料的空白。

3、家畜上的基因沉默

基因沉默技術還可作為一項新技術應用于畜牧業的遺傳育種領域，尤其是豬的育種。第一，豬育種研究中，應用RNA干擾的基因沉默技術可以促進生長，提高肉質。已有的研究表明，豬的生長發育過程是一系列正調控基因和負調控基因共同作用的結果，這一普遍規律同樣適用于與育種密切相關的重要經濟性狀。如生長速度受生長激素基因的正調節和生長抑制素基因的負調節，肌肉的發育與組成受胰島素樣生長因子正調節和肌細胞生長抑制素基因的負調節，脂肪組織的發育亦然。因此，育種實踐中可以根據育種的需要，利用基因沉默技術，一方面抑制牛長和肌肉的負調控，另一方面加強脂肪組織發育的負調控，從而達到促進生長，提高瘦肉率的目的。不僅如此，哺乳動物功能基因組的進展和中同一丹麥家豬基因組計劃的順利實施，必將大大深化對家豬生長機理的認識，并探明肌肉一脂肪組織調控的精細機制，這將在不影響肌間脂肪組織發育的前提下，利用基因沉默技術特異性抑制背部脂肪的沉積(背膘厚)，從而達到提高肉質的目的。第二，豬育種研究中，基于RNA干擾的基因沉默技術可用于抗病育種，即針對危害大、傳播力強的豬病毒性傳染病，如豬瘟、豬繁殖呼吸綜合征等，利用基因沉默技術設計特異性的沉默載體來抑制病毒關鍵蛋白的轉錄，干擾病毒的復制和組裝，從而達到抗病目的。第三，就育種的路線來說，基于RNA干擾的基因沉默技術就有可能成為未來轉基因豬育種的關鍵過渡環節。在國家的重視下，我國的轉基因豬研究已經取得了突破性的進展，積累了雄厚的技術儲備。我國早在20世紀80年代末就建立了成熟的豬顯微注射轉基因技術，最近又成功構建了體細胞克隆豬，從而能采用體細胞打靶～核移植路線進行轉基因育種。然而，目前的豬轉基因育種仍有兩個難題，一是現有轉基因技術的不完善，二是難于選擇合適的育種靶基因。家豬基因組計劃的順利實施，進一步深化對家豬基因功能以及基因間相互作用的理解，并在不久的將來提供大量候選基因作為轉基因育種的靶基因，因此預計靶基因選擇的困難是暫時性的。目前最重要的是大力解決技術上的困難，即轉基因技術的不完善問題。轉基因技術的不完善突出表現在兩個方面：一是已有的轉基因豬育種實踐證明，外源促生長基因的過表達往往會干擾豬正常的生長發育過程，因此基于內源基因的測控要優于基于外源基兇的調控，小鼠基因沉默技術正好提供了內源基因調控的理想技術平臺。然而目前的小鼠基因沉默技術還主要依賴于原核注射法，缺陷在于轉基因的隨機串聯整合容易產生副效應，不利于穩定育種。體細胞打靶—核移植路線，雖然解決了轉基因的定點和單拷貝整合問題，但體細胞打靶—克隆的難度和低效性卻是一個瓶頸。鑒于基因沉默的綜合效應只能在動物水平進行評價，因此，基岡沉默育種的成功突破可能需要篩選和嘗試數個備選基因，這個過程不適合采用體細胞打靶—核移植路線。理想的方案是在豬轉基因育種研究中將RNA干擾技術、原核注射法和體細胞打靶—核移植路線有機結合起來，即首先利用原核注射路線制備基因沉默的轉基因豬。進行育種靶基因的初步篩選，對勝出的靶基因則采用體細胞打靶—核移植路線作為最終育種路線。

4、基因沉默(干擾)技術的應用前景

RNAi領域之所以具有如此強大的生命力，有兩個關鍵：一是RNAi是真核生物普遍存在的保守的生命機制，執行多種重要的生理功能；二是RNAi在基岡功能、疾病模型、遺傳育種等多個領域有巨大的應用潛力。目前，哺乳動物RNAi研究雖然取得了引人矚目的成就，但作為一種全新的領域和技術，預計還有巨大的上升空間。未來的哺乳動物RNAi研究將呈現以下四方面的趨勢：①在細胞水平，RNAi的基因功能研究將和基因芯片技術有機結合，向大規模、高通量的基因組水平發展。在這方面，國內外有關學者已經進行了大膽的嘗試。②在動物個體水平，以RNAi為基礎的動物轉基因技術將得到快速發展。③在醫學領域，RNAi介導的基因治療和新藥研發將逐步從基礎研究向臨床應用轉移。④在畜牧領域，以RNAi為基礎的基因沉默技術作為一種家畜育種手段將發揮很大的作用。作為家畜的模式動物——小鼠的基岡沉默是所有工作的前期探索，國家自然科學基金資助項目“應用RNA干擾技術制備EGFP基因沉默小鼠的研究”正是以綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因。以建立、提高以及完善動物個體基因沉默技術為目標，重點是對不同沉默載體在動物個體水平的表現進行系統的評估和優化，為家畜的基因沉默奠定堅實的基礎，以促進家畜沉默技術的盡快發展，推廣應用于畜牧業現代化生產中。