正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選亞麻籽餅粕中亞麻木酚素的提取工藝

摘要：通過(guò)對(duì)亞麻籽餅粕中開(kāi)環(huán)異落葉松樹(shù)脂酚二葡萄糖苷的提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，并結(jié)合TLC結(jié)果，確定了提取溶劑為0.1mol KOH溶于1 L70％乙醇，料液比為1：8，提取5h。然后利用大孔吸附樹(shù)脂與TLC相結(jié)合的方法，探討了亞麻籽中SDG的分離純化，并根據(jù)HPLC分析結(jié)果確定了最佳的分離純化工藝條件。結(jié)果表明：KOH－乙醇－水提取與大孔吸附樹(shù)脂相結(jié)合制備SDG提取物的方法與傳統(tǒng)分離方法相比，得率高、工藝操作簡(jiǎn)單且安全無(wú)毒。

關(guān)鍵詞：亞麻籽餅粕；亞麻木酚素；正交試驗(yàn)；薄層層析；高效液相

中圖分類(lèi)號(hào)：S563.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006－6500(2008)02－0001－03

木酚素(也稱(chēng)木脂素)是植物中含有的一類(lèi)生理調(diào)節(jié)物質(zhì)，可分為游離的脂溶性木酚素(Iigans)和含糖基的水溶性木酚素(lignan glucosides)。亞麻(Linum ustitatissimum Linaceae)籽種皮中富含木酚素類(lèi)物質(zhì)，其中以異落葉松樹(shù)脂酚二葡萄糖苷(Secoisolariciresinol Diglucoside，簡(jiǎn)稱(chēng)SDG)為最主要的活性成分。SDG具有抑制人體乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減輕婦女絕經(jīng)期癥狀，預(yù)防結(jié)腸癌、前列腺癌，增強(qiáng)自身免疫功能等作用。SDG的提取方法常見(jiàn)的是有機(jī)溶劑提取、超臨界流體萃取、酶法提取、微波輔助提取法州等，但是這些提取方法，均沒(méi)有考慮到SDG在亞麻籽餅粕中是與某些不確定成分結(jié)合成絡(luò)合物而存在的，導(dǎo)致提取率很低或者根本提取不到SDG。本研究采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化KOH－乙醇－水提取SDG工藝，并與大孔吸附樹(shù)脂相結(jié)合制備和純化SDG提取物，可望提高工藝安全性和經(jīng)濟(jì)性，并為工業(yè)化分離純化SDG提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

原料：亞麻籽餅粕由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司提供。主要儀器：shimadzu sCL-6A高效液相色譜儀(日本島津公司)?；瘜W(xué)試劑：SDG標(biāo)準(zhǔn)品由chromadex Inc提供；DM-21型大孔樹(shù)脂，山東魯抗樹(shù)脂廠提供；乙醇、氫氧化鉀為分析純，甲醇為色譜純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樹(shù)脂處理 將DM-21型大孔吸附樹(shù)脂濕態(tài)裝柱，用3BV的乙醇通柱處理，流速為2BV／h；水洗至無(wú)味或乙醇含量小于1％；然后用3BV的4％氫氧化鈉溶液浸泡2 h，通柱，流速為2BV／h；水洗至pH為7；再用3BV的4％鹽酸或硫酸溶液浸泡2h，通柱處理；水洗至pH 6-7，備用。

1.2.2SDG薄層層析(TLC)方法的建立 毛細(xì)管吸取樣品溶液于硅膠板(GF254)上點(diǎn)樣，吹干溶劑后，置于展開(kāi)劑中展開(kāi)完全。取出薄層層析板吹干，用硫酸乙醇溶液顯色，計(jì)算比移值R_f。

1.2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化KOH－乙醇－水法提取SDG

(1)配制醇?jí)A溶液

配制不同濃度的乙醇溶液(以酒精計(jì))，根據(jù)乙醇量加入一定量的氫氧化鉀，配成4％(W／V)濃度的氫氧化鉀醇溶液。

(2)配制硫酸醇溶液

量取一定量濃硫酸，再加入一定量的無(wú)水乙醇，使其成為20％(V／V)的硫酸醇溶液。

(3)sDG提取正交試驗(yàn)

每份試驗(yàn)樣品準(zhǔn)確稱(chēng)取50.0g亞麻籽餅粕放入容器，采用L₉(3)⁴做正交試驗(yàn)，按亞麻籽餅粕與醇?jí)A溶液的不同比例(W／V)加入醇?jí)A溶液，攪拌一定時(shí)間后，緩慢加入20％硫酸醇溶液中和，邊加邊測(cè)定溶液的pH值，使提取液的pH為7。過(guò)濾，濾渣用70％乙醇反復(fù)洗至流出液點(diǎn)TLC無(wú)顯色為止，濾液濃縮(縮至無(wú)乙醇味)。試驗(yàn)因素與水平如表1。

1.2.4SDG粗提液的分離純化將濃縮后的粗提液分別上樹(shù)脂柱，繼續(xù)用蒸餾水洗去雜質(zhì)直至流出液清澈。用60％的乙醇溶液洗脫柱子，洗至流出液TLC檢測(cè)無(wú)亞麻木酚素時(shí)停止。合并乙醇洗脫液，濃縮干燥。再將樣品在100℃水浴中用無(wú)水乙醇反復(fù)回流，直至流出液TLC檢測(cè)無(wú)亞麻木酚素時(shí)停止。合并溶液，濃縮干燥得純化樣品。

1.2.5HPLC法測(cè)定SDG的含量色譜條件為KromasilC-18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；柱溫25℃；流速1.0mL／min；流動(dòng)相，甲醇－水(20：80)，梯度洗脫，0～20min；進(jìn)樣量10μL。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量SDG標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成濃度為1mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以2，4，6，8，10μL進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取每組樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6方法考察

(1)精密度試驗(yàn)

精確吸取同一供試樣品溶液，相同液相條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，進(jìn)行HPLC分析。測(cè)得樣品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.18％。

(2)重復(fù)性試驗(yàn)

精確稱(chēng)取同一批樣品，按樣品測(cè)定方法平行分析5次。平均含量為32.934％，RSD=1.67％(n=5)。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一濃度的樣品每天進(jìn)樣一次，連續(xù)6d測(cè)定樣品含量。平均含量為28.45％，RSD=1.02％(n=6)，表明供試溶液穩(wěn)定。

(4)加樣回收率試驗(yàn)

精確稱(chēng)取SDG標(biāo)品0.03g，甲醇溶解至50mL備用。精確稱(chēng)取已知SDG含量的樣品9份，每份0.1g，處理后加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定SDG含量。平均回收率為99.28％，RSD=1.22％(n=9)。

2 結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2結(jié)果可知，各因素對(duì)SDG提取率影響依次為A>B>C，即乙醇濃度和物料比對(duì)SDG提取影響較大。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際中提取效果和時(shí)間，并根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果，確定了A282C3提取條件較為合適，即提取溶劑為0.1mol KOH溶于1L70％乙醇，料液比為1：8，提取5h時(shí)，SDG提取的較為完全。

2.2樹(shù)脂型號(hào)及TLC條件

吸附量和選擇性是衡量大孔樹(shù)脂分離天然產(chǎn)物的重要指標(biāo)，雖然SDG是一個(gè)二糖苷，具有一定極性，但實(shí)際應(yīng)用中，樹(shù)脂的極性、比表面積和合適的孔徑都對(duì)目標(biāo)提取物的吸附和解吸率起一定作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，DM-21型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)SDG選擇性好，靜態(tài)飽和吸附量和解吸率較高。當(dāng)展開(kāi)體系為正丁醇－乙酸－水(4：1：5)或乙酸乙酯－甲酸－水(8：1：1)時(shí)，分離效果較好，SDG的Rf值約為0.49。顯色劑為20％硫酸醇液，或在254nm紫外熒光顯色，含SDG的點(diǎn)顯紫色。

2.3SDG分離純化及HPLC法含量測(cè)定

將粗提物重新用DM-21大孔吸附樹(shù)脂吸附，水洗除雜質(zhì)，60％乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮干燥，再將樣品在100℃水浴中用無(wú)水乙醇反復(fù)回流，干燥后得純化樣品。

與標(biāo)品色譜條件相同，采用甲醇一水體系，梯度為甲醇20％-100％，20min條件下HPLC檢測(cè)，樣品出峰與標(biāo)品一致。以峰面積(y)對(duì)進(jìn)樣量(x)進(jìn)行線性回歸，回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：y=41278.2x+564，r=0.9996，色譜峰峰面積與進(jìn)樣量關(guān)系良好。原亞麻籽餅粕含SDG為1.64％，純化后SDG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.93％。圖1分別為A：SDG標(biāo)準(zhǔn)品，B：堿乙醇法SDG粗提濃縮物，C：大孔樹(shù)脂純化后的檢測(cè)譜圖。

3 結(jié)論

通過(guò)KOH－乙醇－水提取對(duì)SDG提取工藝的正交試驗(yàn)，確定了在提取溶劑為0.1 mol KOH溶于1 L70％乙醇，固液比為1：8，提取5h的條件下，SDG提取的較為完全，粗提物產(chǎn)率達(dá)4.98％。

測(cè)定表明，DM-21型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)SDG選擇性好，靜態(tài)飽和吸附量和解吸率較高。而且，提取過(guò)程中配合SDG薄層層析方法，可實(shí)現(xiàn)SDG的快速定性分析，適用于亞麻木脂素生產(chǎn)過(guò)程中的過(guò)程監(jiān)控。

HPLC檢測(cè)原亞麻籽餅粕含SDG為1.64％，經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂分離及純化后獲得良好效果，使SDG質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到32.93％。KOH－乙醇－水提取與大孔吸附樹(shù)脂相結(jié)合制備SDG提取物的方法與傳統(tǒng)分離方法相比，得率高、工藝操作簡(jiǎn)單且安全無(wú)毒。此方法可望提高工藝安全性和經(jīng)濟(jì)性，并為工業(yè)化分離純化SDG提供理論依據(jù)。