白藜蘆醇對運動大鼠紅細胞膜抗氧化能力、ＡＴＰ酶活性和血漿ＮＯ的影響

摘 要：為探討大運動量訓練對紅細胞膜自由基代謝狀況發生變化的可能原因及白藜蘆醇對其影響。將30只雄性SD大鼠，隨機分為3組，分別為對照組(A)、訓練組(B)和訓練+白藜蘆醇組(C)，進行8周遞增負荷跑臺訓練，采用分光光度法觀察8周遞增負荷跑臺訓練和白藜蘆醇對紅細胞膜SOD、GSH-Px、CAT、MDA、Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase和血漿NO的影響。結果表明：大強度運動后SOD、CAT活性的上升不明顯，而MDA、NO含量明顯升高，GSH-Px活性明顯下降。白藜蘆醇在一定程度上對訓練中增加的氧自由基具有清除作用，提高訓練鼠大強度運動后ATPase活性，在一定程度上改善內皮細胞NO的分泌，有利于大運動量訓練后紅細胞膜功能的恢復。

關鍵詞：白藜蘆醇；紅細胞膜；抗氧化能力；三磷酸腺苷酶；一氧化氮；跑臺訓練

中圖分類號：G804.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-7116(2008)03-0101-04

Effects of resveratrol on anti-oxidative ability，ATPase activity and serum NO of erythorocyte of exercising rats

ZHANG Lin1，2，WU Sheng-qi2，XIONG Zheng-ying3，DENG Shu-xun1

（1.School of Physical Education，South China Normal University，Guangzhou 510631，China；

2.School of Physical Education，Nanyang Teachers’ College，Nanyang 473061，China；

3.Institute of Physical Education and Institute of Exercise Biology，Shanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Abstract: In order to probed into the possible causes for the change of metabolism of free radicals of erythorocyte as a result of high intensity training and the effects of resveratrol on such a change， the authors randomly divided 30 male SD rats into 3 groups， which are respectively the control group (A)， training group (B) and training + resveratrol group (C)， put these rats on treadmills for 8 weeks of training with gradually increased loads， applied the spectrophotometric method to observe the effects of resveratrol and the 8 weeks of load gradually increased treadmill training on the SOD， GSH-Px， CAT， MDA， Na+， K+-ATPase， Ca2+-ATPase and serum NO of erythorocyte， and revealed the following findings: after high intensity exercising the increase and SOD and CAT activities is not significant， while MDA and NO contents increase significantly， and GSH-Px activity decreases significantly. To a certain extent， resveratrol has the function of eliminating oxidation free radicals increased in training， increases ATPase activity of the trained rats after high intensity exercising， improves the secretion of NO of endothelial cells， and facilitates the recovery of erythorocyte functions after high intensity training.

Key words: resveratrol；erythorocyte；anti-oxidative ability；ATPase；NO；treadmill training

運動可引起紅細胞自由基代謝異常，抗氧化酶活性改變，嚴重時可引起紅細胞膜流動性下降，細胞結構功能喪失，引起溶血、貧血，致使出現運動性疲勞。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，其藥理活性極為廣泛，特別是對心血管系統的作用，以及抗氧化、抗癌、抗炎等作用比較明顯[1-3]，研究表明該藥的作用與其抗氧化特性有關，在運動醫學領域有著廣闊的應用前景[4-5]。本實驗通過白藜蘆醇對遞增強度訓練大鼠紅細胞膜抗氧化水平、ATP酶活性和血漿NO含量的研究，旨在探討紅細胞抗氧化系統對運動訓練的反應，從一個角度研究疲勞產生的機制及為尋找抗疲勞輔助藥物提供一定的參考。

1實驗對象和方法

1.1實驗對象

雄性SD大鼠30只，2月齡，體質量180~220 g，由陜西中醫研究所實驗動物飼養中心購入，同時購入基礎飼料，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2實驗設計

將實驗大鼠隨機分為對照組（A）、運動組（B）、運動+白藜蘆醇組（C），每組10只。動物飼養室內溫度22~26℃，濕度44%~72%，自然光照明。動物訓練模型根據文獻[5]略加改動：A組安靜籠飼養，自由飲食攝水；B、C組于動物跑臺上先進行5周的適應性訓練，然后進行3周的大強度耐力訓練。適應性訓練期間每天訓練25 min，每周6 d，坡度為0°，跑速每周分別以15、22、27、31和35 m/min遞增，共5周；大強度訓練期間每天訓練35 min，每周6 d，坡度為0°，速度為38 m/min，共3周，C組每天按50 mg/kg的劑量灌胃白藜蘆醇，白藜蘆醇購自西安天行健生物工程公司，灌胃劑量按每周大鼠體重變化作適當調整。A、B組分別灌胃相同體積的生理鹽水作對照。訓練實驗結束后次日麻醉處死，股動脈取血，肝素抗凝。

1.3紅細胞膜制備

取肝素抗凝血，2 000 r/min 4℃離心5 min，除去血漿和灰白色的白細胞層，按1∶2（V/V）左右的比例加入150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl配置成pH為7.4~7.5的緩沖液，將沉淀的紅細胞懸浮，繼而以2 000 r/min離心5 min，除去上清液。如此重復洗滌3次。沉積的紅細胞按1∶10（V/V）加入預冷的雙蒸水，均勻攪拌2 min，待完全溶血后，8 000~10 000 r/min 4℃離心20 min，將沉淀重復上法再洗滌3次，即可得到沉淀的乳白色的紅細胞膜樣品。

1.4測試方法

膜蛋白含量測定：考馬斯亮藍染色法；ATP酶的測定：定磷法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定：黃嘌呤氧化酶法；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性測定：DTNB法；過氧化氫酶（CAT）活性測定：可見光法；MDA含量測定：TBA法；NO測定：硝酸還原酶法（以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所）

1.5統計處理

全部數據處理在計算機Excel中進行，以 ±s表示，組間t檢驗進行統計分析。

2實驗結果

2.1白藜蘆醇對大強度耐力訓練大鼠紅細胞膜抗氧化水平的影響

表1結果顯示，運動組同對照組相比較：大鼠紅細胞膜SOD、CAT活性都略有升高，差異均無顯著性（P>0.05），GSH-Px活性有顯著降低（P<0.05），MDA質量摩爾濃度有顯著升高（P<0.05），運動+Res組與運動組比較，大鼠紅細胞膜SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性，均呈顯著性升高（P<0.05），MDA質量摩爾濃度顯著下降（P<0.05）；運動+Res組與對照組相比較，SOD、CAT活性均有顯著性升高（P<0.05），其余各指標均略有升高，差異均無顯著性（P＞0.05）。

2.2白藜蘆醇對運動大鼠紅細胞膜ATP酶活性和血漿NO的影響

表2結果顯示，運動組同對照組相比較：大鼠紅細胞膜Na⁺，K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性均略有降低，差異無顯著性（P>0.05）；運動+Res組與運動組比較，大鼠紅細胞膜Na⁺，K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性都呈顯著性升高（P<0.05）。運動組血漿NO濃度極顯著高于對照組血漿NO濃度（P<0.01）；運動+Res組血漿NO濃度與對照組無顯著性差異（P>0.05），與運動組差異有極顯著性（P<0.01）。

3分析討論

3.1白藜蘆醇對運動訓練大鼠紅細胞膜抗氧化能力的影響

白藜蘆醇具有較強的抗氧化、抗自由基作用。白藜蘆醇可直接清除 、 、 、 [7]。白藜蘆醇為兩親分子，易透過細胞膜，還可進一步穿過胞漿進入細胞核，更好地發揮抗氧化作用。實驗表明，白藜蘆醇在水相中（即膜外）起清除自由基的作用，防止多聚不飽和脂肪酸過氧化，而且如果在脂顆粒形成前加入白藜蘆醇，其有效濃度約為脂顆粒形成后再加入的7倍，說明部分白藜蘆醇摻入了脂質膜結構并在膜內發揮清除自由基，防止脂質過氧化的作用[8]。Jang M.等[9]報道白藜蘆醇還能減少H₂O₂產生，使髓過氧化酶和氧化型谷胱甘肽還原酶的活性正常化，恢復GSH水平和SOD活性，從而增強機制的抗氧化、自由基防御系統，間接發揮其抗氧化、抗自由基作用。

本實驗結果顯示，遞增強度運動后紅細胞膜SOD活性略有升高，這可能是由于訓練中采用的運動強度逐漸加大，紅細胞內氧合血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白的速率加快，氧自由基的生成不斷增加；氧自由基的大大增加會刺激紅細胞中的SOD產生適應性反應以便不斷地將氧自由基快速地轉化。隨著SOD被大量地激活用以催化 的歧化反應，與此同時，這一反應的產物H₂02也迅速增加，而H₂02可以破壞SOD酶的活性中心金屬配位結構，使得SOD活性受到抑制，因此SOD活性表現為訓練后不顯著升高。GSH-Px是以H₂O₂為底物的抗氧化酶，GSH-Px能使H₂02還原為H₂O和O₂。因此，H₂O₂的升高，消耗了一定量的GSH-Px使其活性降低。運動后，大鼠體內CAT活性變化不明顯，提示CAT活性在運動中的變化有其特異性，它的升高或下降可能與運動時的強度和時間密切相關，此機理尚不清楚，還需要有大量的實驗來加以證明。

由于白藜蘆醇所具有的清除自由基的作用，服藥訓練鼠受較少氧自由基攻擊，使訓練后細胞內的

通過SOD轉化的量減少，產物H₂O₂的堆積相對減少，說明SOD受H₂O₂的抑制作用減少，所以運動后SOD活性出現了上升趨勢。隨著H₂O₂的減少，消耗的GSH-Px也減少，其活性隨之升高。因此訓練后GSH-Px活性也出現顯著升高趨勢。由于白藜蘆醇使運動過程中細胞內部分自由基已經被抗氧化系統清除，脂質過氧化反應造成的破壞程度降低，運動大鼠紅細胞膜MDA生成量減少。本實驗結果提示，白藜蘆醇對訓練鼠紅細胞膜抗氧化水平起到一定的促進及恢復的輔助作用。

3.2白藜蘆醇對運動訓練大鼠紅細胞膜ATP酶活性的影響

運動產生自由基攻擊細胞膜，降低膜流動性繼而影響到細胞膜上的三磷酸腺苷酶（ATPase）。研究報道，青少年進行次極限強度訓練后，紅細胞膜Ca²⁺-ATPase活性下降和Na⁺，K⁺-ATPase活性升高。力竭游泳后大鼠腸組織Na⁺，K⁺-ATPase活性下降[10]。一次急性運動后由于ATP大量消耗，紅細胞膜內ATP濃度下降7%，膜上Na⁺，K⁺-ATPase就不能正常工作[11]。

本實驗中遞增負荷訓練并未使大鼠紅細胞膜Na⁺，K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性發生顯著變化，提示可能由于紅細胞內SOD、GSH-Px快速地參與清除細胞內所生成的氧自由基，避免了自由基對膜上功能蛋白的攻擊，削減了對ATP酶的影響。研究表明，白藜蘆醇明顯改善Na⁺，K⁺-ATPase活性，最大改善率在60%以上，其作用與強的松相當或更優[12]，白藜蘆醇還可有效抑制脊髓損傷后受損局部的Ca²⁺-ATPase活性下降[13]。本實驗服藥訓練鼠運動后Na⁺，K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性升高，可能提示，白藜蘆醇起了一定的作用。服藥鼠訓練后ATPase活性有較大提高，有利于運動開始后ATPase不被大量自由基氧化，運動后此酶又能較快得以恢復。表明白藜蘆醇ATP酶活性影響是顯著的，保護了膜免受損傷，但是其藥理學機制需要有更多的實驗加以支持。

3.3白藜蘆醇對運動訓練大鼠血漿NO的影響

一氧化氮(NO)作為一種活性氮自由基，是繼活性氧自由基之后生物自由基領域的又一新的研究前沿。NO作為重要的生物信使，廣泛參與細胞間與細胞內的信息傳遞。但NO生成過多，將通過與機體內蛋白質、脂肪、核酸等生物分子相互作用損傷組織細胞，對機體產生毒性作用。運動訓練對NO的影響隨運動的強度和時間不同而不同。短時間運動后即可激活內皮與骨骼肌的NOS，增加NO的生成[14]，而持久鍛煉則能使NOSmRNA的表達上調，提高NOS的數量，從而增加內皮和骨骼肌產生NO的能力[15]。Roberts CK等[16]的實驗表明大鼠在45 min的力竭性跑臺訓練后即刻肌肉NOS活性提高了37%，而且Manukhina EB[14]等也發現急性運動后大鼠心、肝、脾、腎、腸道的NO生成量均增加。運動中NO生成量增加，可能是由于運動強度的增加，血漿中兒茶酚胺的濃度逐漸增加，并與血管內皮細胞上的α-腎上腺素能受體結合，可以刺激內皮細胞釋放NO；同時在運動過程中，隨著心輸出量的增加和血液重新分配，導致骨骼肌和心肌血流量增加，血流速度加快，必然增加血流對內皮細胞的切壓力，增加NOS活性，從而促進內皮細胞分泌NO，運動中產生的大量NO是一種重要的氮自由基，對組織細胞有傷害作用[17]。

本實驗中遞增負荷運動使大鼠血漿NO水平顯著升高，由此證明，此強度運動確實刺激機體產生過量的NO自由基，影響機體NO的濃度及代謝。而服藥訓練鼠運動后NO水平明顯下降，說明白藜蘆醇在一定程度上改善內皮細胞NO的分泌。白藜蘆醇在動物體內是如何減少NO過量生成及與其他相關因素的關系還有待于更多的實驗證明。

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[編輯：鄭植友]