ＨＰＬＣ法測定紫草中的左旋紫草素的含量

摘 要：目的：建立紫草中左旋紫草素的含量測定方法。方法：采用HPLC法，色譜柱為YWG-C-18，流動相為甲醇-0.025mol/L磷酸(80∶20)，測定波長：516nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，結(jié)果：左旋紫草素在0.176~0.880μg間，左旋紫草素進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性y=2×10⁷x+31103，R²=0.9993，測得紫草中左旋紫草素的平均含量為1.78%。結(jié)論：應(yīng)用HPLC法測定紫草中的左旋紫草素含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞：紫草；左旋紫草素；HPLC；含量測定

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)05-041-02

紫草(Alkanna Tinctoria)是傳統(tǒng)中藥之一，屬于紫草科多年生草本植物，以其干燥根入藥。《中國藥典》有收載，謂其性寒、味甘咸、歸心肝經(jīng)，具有涼血、活血、解毒透疹、補中益氣作用。紫草的藥理作用很多，如：抗生育作用、抗菌、抗炎、抗癌、降糖、保肝及提高肌體免疫功能。紫草中的有效成分為紫草寧衍生物，屬萘醌類色素^[1]。《中國藥典》2005版<一部>采用紫外分光光度法測定左旋紫草素的含量。本實驗采用HPLC(高效液相色譜)法對紫草中的左旋紫草素進(jìn)行含量檢測。

1 儀器與試劑

實驗中紫草由亞洲大藥房提供，左旋紫草素對照品由中國生物制品藥品檢定所提供，其余試劑均為分析純。高效液相色譜儀(紫外可見檢測器，LC-05Pi液體泵)，AG204電子天平，KQ2200B超聲機(jī)

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件^[2，3]

色譜柱：YWG-C-18柱；流動相：甲醇-0.025mol/l磷酸(80∶20)；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；測定波長：516nm。按左旋紫草素計算理論塔板數(shù)為2500(>103)。在此條件下，樣品中左旋紫草素與其他相關(guān)峰均能達(dá)到基本分離。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱定5.5mg左旋紫草素對照品置10mL容量瓶中，用甲醇定容到10mL，得0.55mg/mL對照品溶液。用移液管精密移取4mL于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容到50mL，得濃度為0.044mg/mL對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制^[4]

稱取紫草10g，加入95%乙醇100mL，超聲20min。放冷過濾，濾渣加入95%乙醇50mL超聲10min。放冷過濾，合并濾液，加入2%的氫氧化鈉溶液使溶液呈堿性(變藍(lán)色)，過濾，濾液加酸調(diào)pH到呈酸性(變紅色)，過濾，濾液減壓濃縮回流至20mL左右。在50℃下進(jìn)行干燥。精密稱定提取物的重量，把提取物加入甲醇，超聲溶解，定容在100mL的容量瓶中。

2.4 線性關(guān)系與標(biāo)準(zhǔn)曲線^[5]

精密移取已經(jīng)配制好的0.044mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL，10.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別吸取20ul，注入液相色譜中，測定色譜峰面積，得回歸方程y=2×10⁷x+31103，R₂=0.9993。

2.5 精密度考察

用上述方法制備的供試品連續(xù)進(jìn)6針，測定峰面積。考察相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。見下表：

結(jié)果：精密度考察符合要求。

2.6 回收率的測定^[6]

方法：取紫草粉末兩份，各10g精密稱定，置100mL具塞三角瓶中，一份加入左旋紫草素對照品溶液(0.044mg/mL)20mL作為對照品溶液；另一份不加作為樣品溶液。然后各加入95%乙醇100mL超聲20min。放冷過濾，濾渣加入95%乙醇50mL超聲10min。放冷過濾，合并濾液，減壓濃縮回流至20mL左右。在50℃下進(jìn)行干燥。精密稱定提取物的重量，把提取物加入甲醇超聲溶解，定容在100mL的容量瓶中。見表2：

結(jié)果：回收率符合要求。

2.7 紫草中左旋紫草素的含量測定

方法：將不同批次的中藥紫草制備成供試品進(jìn)針，測定含量。見表3：

3 討論

(1)在紫草的提取過程中，浸出液要濃縮到溶液體積20mL左右，使得乙醇的含量很少，才能利用加堿使紫草素溶于水相，過濾后加酸使沉淀析出。在加堿時不要劇烈搖動、攪拌，以免產(chǎn)生乳化效果，不利于提取；加酸時要使溶液變成紅色，靜置析出。

(2)由于紫草中紫草素含量很低，所以在進(jìn)液相時濃度要比較大，使得誤差能夠減少。進(jìn)針后，其色譜峰周期過長，在對照品出峰時間過后可以將流速由1.0mL/min提高到1.5mL/min。

(3)測定方法的選擇。有文獻(xiàn)報道用紫外分光光度法及薄層掃描測定紫草素的含量。本實驗采用高效液相色譜法測定紫草中的左旋紫草素的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高。

(4)樣品測定結(jié)果表明，通過對樣品顏色的觀察發(fā)現(xiàn)，左旋紫草素含量高的成品顏色深紅，而所測含量較低的成品顏色較淺，這可能與紫草原藥材的質(zhì)量有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 盧賀起，丁家欣，魏雅川.紫草的實驗研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息，1998，5(1)：20.

[2] 馬瑛，王嗣芩，黃猛.HPLC測定紫草中紫草素含量[J].中國藥學(xué)，2000，35(20)：98.

[3] 李忠良，張敏，郭蘭建.紫草中紫草素的含量測定[J].藥物分析，1986，6(1)：41.

[4] 楊曉笛，盧鋒，黃美充.中藥紫草有效成分的提取[J].汕頭大學(xué)學(xué)報，2002，17(4)：67.

[5] 孟憲生，沙明，曹愛民，張東方.HPLC法測定紫草及其制劑紫金油中左旋紫草素的含量[J].中草藥，2003，34(7)：615.

[6] 陳發(fā)奎.常用中草藥有效成分含量測定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：732~732.

(責(zé)任編輯：陳涌濤)