川牛膝的ＨＰＬＣ指紋圖譜研究

摘 要：目的：采用HPLC法構(gòu)建川牛膝藥材的化學(xué)指紋圖譜。方法：采用Waters 2695 高效液相色譜儀，色譜柱為Symmetry^reg;C₁₈(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流動相為甲醇-水二元梯度洗脫；流速為0.9ml/min；柱溫為35℃；檢測波長為266nm。結(jié)果：測定基地產(chǎn)及市場上流通的樣品共18批次，標(biāo)示了11個共有峰，其指紋圖譜相似度均在0.9以上，指紋圖譜整體面貌基本一致。結(jié)論：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為川牛膝藥材的定性鑒別和藥材內(nèi)在質(zhì)量評價提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：川牛膝；指紋圖譜；HPLC

中圖分類號：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-027-03

川牛膝為莧科杯莧屬植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，是著名的川產(chǎn)道地藥材之一，具有逐瘀痛經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋的功效^[1]。川牛膝始見唐代藺道人的《仙授理傷續(xù)斷秘方》。在功效上，目前全國的一些權(quán)威著作一致認(rèn)為“懷牛膝和川牛膝的功效基本相同，但是前者偏于補腎強筋骨，而后者偏于活血化瘀” ^[2]。現(xiàn)在藥理學(xué)研究表明，川牛膝不僅能活血化瘀，還有很好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用。

目前國內(nèi)對川牛膝的研究主要集中在其化學(xué)成分及藥理研究方面，缺乏綜合評價藥材品質(zhì)的方法和標(biāo)準(zhǔn)，且川牛膝在長期的應(yīng)用和栽培的過程中，種內(nèi)產(chǎn)生很大的變異，出現(xiàn)倫理較多的類型，同時由于加工、儲存等方法的不同，藥材質(zhì)量存在較大的差異，造成目前藥材質(zhì)量不穩(wěn)定和市場藥材質(zhì)量無法評價的局面。本研究通過采用HPLC法建立川牛膝藥材指紋圖譜，為控制川牛膝藥材的綜合質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 試驗材料、試藥、試劑與儀器

1.1 試驗材料、試藥、試劑

川牛膝藥材：經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)峨眉學(xué)院王書林教授鑒定為莧科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)的干燥根，符合2005年版《中國藥典》規(guī)定，見表1。

對照品：杯莧甾酮(cyasterone)由四川省中醫(yī)藥研究所提供。試劑：甲醇(色譜純)，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters2996-2695型高效液相色譜儀；Waters Empower化學(xué)工作站；KQ3200型超聲波清洗器(40KHZ，120W)，昆山市超聲儀器公司；BP-211D型電子分析天平(Max：210g，d=0.1mg)，北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry^reg;C₁₈(5μm，4.6×250mm，Waters公司)；流動相：甲醇-水二元梯度洗脫，如表2；流速：0.9ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：266nm；進(jìn)樣量：20μl；運行時間：35min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

取杯莧甾酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含60μg溶液，即得。

2.2.2 樣品溶液的制備

取川牛膝藥材細(xì)粉(批號7^#)5g(過四號篩)，精密稱定，置于100ml錐形瓶中，精密量取甲醇50ml，振搖，回流提取1h，放冷，加甲醇補足損失的重量，搖勻，水浴揮干，殘渣加甲醇使溶解，定容至10ml，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得^{[3，4，5，6]}。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，≥5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的RSD在1.3263%～2.1634%之間，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗

取同一批次的川牛膝藥材6份，按上述樣品測定方法分別測定，≥5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的RSD在2.3013%～2.8706%之間，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24h分別進(jìn)樣20μl，≥5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的RSD在2.1181%～2.5066%之間，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜相似度分析

2.4.1 共有峰的標(biāo)定

根據(jù)18批次供試品測定結(jié)果所給出的峰數(shù)，對峰值和峰位等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析、比較，川牛膝藥材高效液相色譜可分離出20多個色譜峰，經(jīng)與杯莧甾酮對照品對照，并比較所有記錄的色譜圖，選取11個共有峰作為指紋圖譜的特征峰，其中9號峰為杯莧甾酮。

圖1 川牛膝HPLC指紋圖譜

2.4.2 共有圖譜模式的建立

根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，以參照物峰(S)的相對保留時間和相對峰面積為1，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。杯莧甾酮為川牛膝藥材中的主要有效成分，且其峰面積在圖譜中相對較大，保留時間適中，故選擇杯莧甾酮為參考峰(S)，以其保留時間和峰面積為1，計算各樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.4.3 圖譜相似度分析

根據(jù)18批樣品的相對保留時間及指紋圖譜的整體譜峰特點對峰進(jìn)行匹配，以相對方面積的平均值建立共有模式，見圖2，以相關(guān)系數(shù)法對樣品的相似度進(jìn)行評價，各樣品相似度結(jié)果見表3，結(jié)果表明，大多數(shù)樣品之間相似度良好，都達(dá)到0.90以上，平均相似度為0.906。

圖2 18批川牛膝樣品指紋圖譜

3 討論

本課題首次將HPLC法運用到川牛膝藥材的鑒定與質(zhì)量評價中，能更加有效地解決藥材化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性的質(zhì)量評價技術(shù)難題。本實驗采用二極管陣列檢測器對指紋圖譜的檢測進(jìn)行了選擇，結(jié)果表明在檢測波長266nm處，色譜圖所包含的信息量更大。從相似度分析結(jié)果來看，18批川牛膝藥材相似度均在0.9以上，表現(xiàn)出良好的相似性。在川牛膝藥材指紋圖譜的共有特征峰中，整體分離度較好，能充分反映出川牛膝藥材醇溶性物質(zhì)的化學(xué)成分特征，可用于川牛膝藥材鑒定及內(nèi)在質(zhì)量評價。在本實驗建立的川牛膝藥材指紋圖譜分析方法中，杯莧甾酮的保留時間適中，與相鄰色譜峰達(dá)基線分離，分離度良好。

本實驗所建立的方法，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求，為進(jìn)一步制訂川牛膝質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 馬英，畢開順，王璽等.HPLC法測定川牛膝中杯莧甾酮的含量[J].中草藥，2000，31(6)：427~428.

[5] 黎萬壽，陳幸，李彬.等.正交法優(yōu)選酒炙川牛膝最佳炮制工藝[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2005，19(4)：54~56.

[6] 黎萬壽，陳幸，李彬.等.正交法優(yōu)選鹽炙川牛膝最佳炮制工藝[J].時珍國醫(yī)國藥，2005，16(12)：1205~1206.

(責(zé)任編輯：萬賢賢)