植物青枯病高效生防菌株ＰＢＷ１培養工藝研究

摘要 植物青枯病生防菌株PBWl對植物青枯病的防效可高達70％以上。本文首先獲得了PBW1500 ml搖瓶培養的最佳條件：30℃、初始pH7、接種量為1％、裝液量為120 mL、搖床轉速為220 r/min；在最佳條件下培養48 h的菌體濃度達4.2×10¹² cfu/mL；同時還對500 mL搖瓶培養過程中菌體生長、還原糖、總糖及pH變化特征進行了研究。此外，本文還在6L全自動發酵罐上對PBWl培養過程中的菌體生長、還原糖、氨基氮、pH和DO的變化特征進行了研究，培養48h的菌體濃度達4.76×10¹²cfu/mL。

關鍵詞 植物青枯病；生物防治；PBW1菌株；培養工藝

中圖分類號 S476.1

植物青枯病是由茄青枯勞爾氏菌(Ralstonia so-lanacearum)引起的一種世界性土傳植物病害，主要發生在熱帶和亞熱帶地區，發生普遍、危害嚴重，此病于1864年首次發現至今已有140多年歷史。青枯病寄主范圍很廣，可侵染44科近300種植物，其中煙草、番茄、茄子、辣椒、花生、馬鈴薯和生姜等被害較嚴重、分布較廣。在我國，植物青枯病主要發生在長江以南地區(福建、廣東、廣西、四川、湖南、安徽、江蘇、浙江和江西等)，近年的調查發現，此病有向長江以北地區(山東等地)發展的趨勢。植物青枯病發病率一般為20％～30％，嚴重的地區可高達100％，甚至毀產絕收。對于植物青枯病的防治研究，國內外一直是以綜合防治為指導思想。綜合防治的重點又是放在抗病育種上，但迄今為止，具有抗青枯病性能的作物品種很少，且抗性極易丟失；嫁接方法防治番茄青枯病雖獲得成功，但技術難度大，難以推廣和普及；水旱輪作在一定程度上能夠較好地防治青枯病，但受地域條件的限制，難以被普遍應用；化學農藥防治雖有一定的防效，但難以達到最低的防治要求，且病原菌很快會對化學農藥產生抗性。由此可見，迄今為止，國內外尚無防治植物青枯病的有效方法。近年來筆者所在實驗室在利用微生物活菌制劑防治植物青枯病方面開展了大量的研究工作，利用獨特的菌種篩選模型篩選出防治番茄、辣椒、茄子、煙草等作物青枯病的高效生防菌株PBW1，為了更好地開發利用生防菌株PBW1防治植物青枯病，降低其培養成本，本文報道了植物青枯病高效生防菌株PBW1的搖瓶培養研究結果和在最佳條件下PBW1搖瓶培養過程中菌體生長、pH、還原糖及總糖變化特征；此外，本文還報道了生防菌株PBW1在6L全自動發酵罐培養過程中菌體生長、總糖及氨基氮的變化特征。本文研究結果為PBW1的大規模培養工藝確定及其培養過程放大奠定了較好的基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌種

為筆者所在實驗室從土壤中分離篩選出的植物青枯病高效生防菌株，暫定名為PBW1、初步鑒定為假單胞桿菌屬。

1．1．2 斜面培養基

蔗糖2％，淀粉2％，酵母膏1％，無機鹽和生長因子適量，瓊脂1.5％～1.8％，pH7。

1．1．3 平板計數培養基

蔗糖1％，酵母膏0.45％，無機鹽和生長因子適量，瓊脂1.8％，pH7。

1．1．4 搖瓶培養基

蔗糖2％，淀粉1.5％，酵母膏1.5％，無機鹽和生長因子適量，碳酸鈣0.6％，pH7。

1．2 主要設備

6L全自動發酵罐(德國B.Braun公司生產)；控溫搖床(上海醫藥工業研究院生產)。

1．3 試驗方法

1．3．1 種子培養

將菌株移入斜面培養基，置于30℃培養箱中培養2～3 d；將斜面菌體挖塊接入搖瓶(500 mL搖瓶裝入120 mL培養基)，在30℃、220 r.min條件下搖床培養48 h。

1．3．2 搖瓶培養

向裝有120 mL發酵培養基的500 mL搖瓶中接人1.2 mL種子液，在30℃、220 r.min的搖床上培養48 h或72 h。考察溫度、培養基裝量、搖床轉速、接種量和初始pH等5個因素對最終培養液中菌體濃度的影響，確定最佳培養條件。

1．3．3 發酵罐培養

將培養48 h的種子液，按1％的接種量(40 mL種子液)接入裝有6L培養基的發酵罐中，溫度控制為30℃，氣液比為1:1，泡敵加入量為0.05％，調節攪拌轉速使溶氧不低于15％。培養過程的pH、溫度及溶氧自動記錄，間歇取樣測定培養液中的菌體濃度、還原糖及氨基氮。

1．3．4 分析方法

培養液中菌體濃度采用稀釋平板計數法測定；還原糖、總糖及氨基氮則分別采用費林試劑法和甲醛法。

2 結果與討論

2．1 搖瓶培養

考察溫度、初始pH、搖床轉速、裝量、接種量等5個因素對PBW1菌株生長的影響，確定其最佳培養條件。

2．1．1 培養溫度

選定溫度為25、30、35℃和41℃進行試驗，由圖1可見溫度在30℃時，培養液中的最終菌體濃度為最大，高達4.5×10¹²。cfu.mL，在25℃和35℃下的菌體濃度分別為2.28×10¹²cfu.mL和7.8×10¹¹cfu.mL，而在41℃時的菌體濃度僅為1.01×10¹¹cfu.mL，菌體基本不生長。據此，可以認為PBW1的生長溫度范圍為25～35℃，其最適生長溫度為30℃。

2．1．2 初始pH

在初始pH為5～10范圍內進行試驗，其結果見圖2，由該圖看出，PBWl在初始pH5～10范圍內均能生長，最適生長的初始pH為7，這時菌體濃度為4.4×10¹²cfu.mL，這表明該菌適宜在pH中性范圍生長。

2．1．3 轉速

由圖3可見，PBWl在轉速分別為130、170、220 r.min和250 r.min條件下培養48 h，培養液中的菌體濃度依次為4.1×10¹¹、1.35×10¹²、2.83×10¹²、4.5×10¹²cfu.mL。轉速越高，供氧量越大，試驗結果可說明在一定條件下溶氧濃度越高，越有利于PBW1的生長。

2．1．4 裝液量

在500 mL搖瓶中分別裝入70、120、170 mL和220 mL培養基(接種量仍為1％)，培養48 h后的菌體濃度依次為4.7×10¹²、4.4×10¹²、2.32×10¹²cfu.mL和9.9×10¹¹cfu.mL(圖4)，結果表明裝液量越少，PBW1生長越快。由于裝液量太少，不利于取樣分析，且裝液量為70 mL時菌體生長和裝液量為120 mL時相近，故裝液量選為120 mL。在相同條件下，裝液量越少，相對供氧量越大，PBW1生長越快，這和轉速試驗結果一致。

2．1．5 接種量

在其他條件相同情況下，接種量分別為0.5％、1％和1.5％時，培養72 h后相應的培養液中的菌體濃度分別為2.82×10¹²、4.2×10¹²、4.6×10¹²cfu.mL，結果表明培養PBWl時，在一定范圍內，接種量越大，菌體生長越快，但接種量為1％和1.5％時培養72 h的培養液中的菌體濃度差別不大(圖5)，因而一般選定接種量為1％。

2．1．6 搖瓶培養的最佳工藝條件

由上述試驗結果可知，在本文試驗條件下，PBWl最佳的500 mL搖瓶培養工藝為：30℃、初始pH7、接種量為1％、裝液量為120 mL、搖床轉速為220 r.min。在一定范圍內，接種量越大，菌體生長越快；搖床轉速越大、裝液量越少，菌體生長越快，這說明在一定范圍內，培養液中溶氧越大，越有利于PBW1的生長。

2．2 PBW1搖瓶培養過程中菌體濃度、pH、還原糖

及總糖變化特征

在最佳工藝條件下進行PBW1的培養，測定其培養過程的菌體濃度、pH、還原糖及總糖變化曲線，所得結果示于圖6。由該圖可見，培養前期菌體生長較快，而培養至約24 h時，菌體生長速度很緩慢，培養至約100 h后，菌體濃度開始下降，這可能是菌體自溶所致。培養開始后pH下降，至約24h，pH降至最低，隨后開始上升，至約48 h時pH上升速度開始變得很緩慢。在培養前期還原糖和總糖消耗速度較慢，但在20～36 h內糖消耗較快，以至于還原糖濃度接近于0，隨后糖濃度基本不變。菌體濃度的變化與pH、還原糖及總糖的變化有一定的相關性，當培養進行至約36 h時，培養液中還原糖和總糖濃度降至很低，pH升到8.51，菌體生長已基本進入平衡期，菌體濃度略有增加，考慮到菌體濃度在48 h以后增加不大，因此，選擇48 h為搖瓶培養終點，此時菌體濃度為4.2×10¹² cfu.mL。

2．3 菌株的發酵罐培養過程特征

圖7所示的為PBW1在全自動發酵罐中的培養過程曲線。由該圖可見，在0～4 h內菌體生長處于延滯期，4～12 h期間菌體生長很快，在隨后的6 h內菌體生長緩慢，并達到最大菌體濃度；18 h以后，菌體濃度出現下降趨勢，結合氨基氮的變化曲線初步判斷，這可能是有部分菌體自溶所致。在0～4 h內還原糖濃度和氨基氮濃度下降很緩慢，在4～12 h內，還原糖濃度、氨基氮濃度降低較快，同時菌體生長速度較快，在隨后的6 h內還原糖和氨基氮濃度下降緩慢，18 h以后，還原糖濃度變化非常緩慢，而氨基氮濃度開始上升，這表明菌體停止生長，可能出現自溶現象。在4 h以前，pH變化緩慢，在4～12 h，pH下降速度較快，說明菌體利用糖產生有機酸，使pH降低較快，12 h以后，pH開始緩慢回升，說明培養液中糖濃度很低，菌體生長開始利用有機酸，使pH出現回升。在2 h前，溶氧濃度降低較為緩慢，但2～4 h內溶氧下降很快，至4 h時降到最低點，這時菌體生長速度較快，為了維持溶氧不低于15％，轉速由600 r.min調至700 r.min，此時，菌體生長很快，耗氧量大，溶氧下降快，約6 h時將轉速由700 r.min增至800 r.min，在9～12 h內，溶氧下降緩慢，隨后的2 h內溶氧開始上升，菌體生長緩慢，在約14 h時，將轉速降為700 r.min，說明菌體可能開始死亡或自溶，到30 h，菌體濃度降至很低，溶氧開始回升。由此可見溶氧變化曲線可反映菌體的生長狀況。

3 結論

(1)以青枯病高效生防菌株PBW1的培養為研究對象，以最終的菌體濃度的高低為指標，研究了PBWl在500 mL搖瓶中的最佳培養條件。結果表明：在本文試驗范圍內，PBWl搖瓶培養的最佳工藝為：30℃、初始pH7、接種量為1％、500 mL搖瓶裝液量為120 mL、搖床轉速為220 r.min。在一定范圍內，接種量越大，菌體生長越快；搖床轉速越大、裝液量越少，菌體生長越快，這說明在一定范圍內，培養液中溶氧越大，越有利于PBW1的生長。

(2)在最佳培養條件下進行了搖瓶培養試驗，結果表明，培養48 h時的菌體濃度達4.2×10¹²cfu.mL；同時獲得了PBW1菌株的搖瓶培養過程中的菌體生長、pH、還原糖及總糖變化特征。

(3)利用搖瓶培養結果，在6L全自動發酵罐上進行了PBWl的培養研究，結果表明，培養18 h的菌體濃度達最大，其值為4.76×10¹²cfu.mL；同時對PBW1在發酵罐培養過程中的菌體生長、pH、還原糖、氨基氮及溶氧的變化特征進行了研究，這為PBWl的大規模培養提供了一定的依據。