５種鏈格孢屬植物病原真菌對１０種殺菌劑的敏感性比較

摘要 離體條件下測定并比較了10種殺菌劑對番茄早疫病菌、蘋果斑點落葉病菌、梨黑斑病菌、煙草赤星病菌和甘藍黑斑病菌等5種鏈格孢屬植物病原真菌的抗菌活性。結果表明，不同種的鏈格孢屬病菌對同一藥劑的敏感性相近；咪鮮胺、啶菌惡唑、苯醚甲環唑、異菌脲、腐霉利等5種殺菌劑對供試病菌菌絲生長的抑制活性最好，其EC₅₀在0.01～1.28ug/mL之間；百菌清對病菌分生孢子萌發的抑制活性最高，其次是醚菌酯和嘧菌酯。

關鍵詞 殺菌劑；鏈格孢屬病菌；菌絲生長；孢子萌發

中圖分類號 S482.2

鏈格孢屬(Alternaria Nees)真菌是重要的植物病原菌屬之一，除少數種可侵染人和動物，引起皮癬、甲癬、顎骨髓炎等疾病外，大多數種可寄生于植物引起包括玉米、小麥、煙草、馬鈴薯、番茄、蘋果、梨、甘藍、人參等的幾十種植物病害。這類病菌的代謝產物即毒素可導致受害植物產生各種癥狀，如黑斑病、褐斑病、莖枯病、赤星病等，嚴重影響作物的產量和品質，給農業生產帶來了巨大損失。過去應用較多的苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈等對這類病害的防效通常較差或無效，市場上專門用于防治這類病害的藥劑品種較少，給生產上選擇防治這類病害的藥劑帶來困難。

本文測定并比較了10種殺菌劑對5種常見鏈格孢屬病菌的離體抗菌活性，旨在了解這些藥劑對鏈格孢屬真菌的活性，以及這些藥劑對鏈格孢屬病菌的作用特點，從而為生產上防治這類病害時科學用藥以及企業開發混配藥劑提供理論參考。

1 材料與方法

1．1 供試病菌

番茄早疫病菌(Alternaria solani)、蘋果斑點落葉病菌(A.mali)、甘藍黑斑病菌(A.brassicae)、梨黑斑病菌(A.kikuchiana)、煙草赤星病菌(A.lon-gipes)，均為本研究室保存菌種。

1．2 供試藥劑

試驗藥劑為95.4％醚菌酯(kresoxim-methyl)原藥(江蘇耕耘化學有限公司)、98.1％腐霉利(pro-cymidone)原藥(浙江禾益農化有限公司)、98.2％多菌靈(carbendazim)原藥(江蘇蘇化集團新沂農化有限公司)、25％嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑(先正達公司)、96％異菌脲(iprodione)原藥(江蘇蘇化集團新沂農化有限公司)、95％三唑酮(triadimefon)原藥(江蘇蘇化集團新沂農化有限公司)、99.3％咪鮮胺(prochloraz)原藥(樂斯化學有限公司)、95.2％苯醚甲環唑(difenoconazole)原藥(江蘇耕耘化學有限公司)、84％啶菌惡唑(SYP-Z048)EC(沈陽化工研究院)、98％百菌清(chlorothalonil)原藥(江蘇寶靈化工有限公司)。除將25％嘧菌酯SC溶于無菌水外，其余原藥均溶于丙酮中制成適當濃度的母液保存于4℃冰箱中備用。

1．3 供試病菌的培養及孢子懸浮液的制備

1．3．1 供試病菌的預培養

將5種供試病菌在馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)平板上，(25±1)℃下黑暗培養，待菌落邊緣接近皿壁時，即可打取菌餅用于試驗。

1．3．2 供試病菌孢子懸浮液的制備

將4種供試病菌番茄早疫病菌、甘藍黑斑病菌、梨黑斑病菌、煙草赤星病菌在PSA平板上，(25±1)℃、12 h∥12 h(D∥L)光照條件下培養8 d后，向培養皿中加入10 mL無菌水，用無菌曲玻棒輕輕洗下菌落中的分生孢子，盡量減少菌絲斷裂。兩層無菌紗布過濾得到分生孢子懸浮液，在顯微鏡下(10×10倍)檢查孢子數，平均每視野60～100個孢子即可。

1．4 藥劑敏感性測定方法

1．4．1 供試藥劑對病菌菌絲生長的影響

采用平皿菌絲生長抑制法測定供試藥劑對各病菌菌絲生長的抑制活性，即在預試驗的基礎上，選擇各藥劑對病菌菌絲生長抑制率在10％～90％范圍內的5個濃度；將配制好的供試藥劑母液按照設定的濃度比例加入到已融化并冷卻至50℃左右的PSA培養基中，充分混勻后分別倒入3個滅菌的培養皿中，制成系列濃度的含藥PSA平板，以不加藥劑但含等量溶劑的PSA平板為對照。用直徑為6 mm的打孔器在預培養的菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，菌絲面朝下接種到含藥培養基平板中央，置于(25±1)℃下黑暗培養，待對照的菌落邊緣接近皿壁時用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，并求出3次重復的平均值，得出各處理的平均菌落增長直徑(一平均菌落直徑-6mm)，并計算各藥劑處理對病菌的菌絲生長抑制率。

抑制率＝[對照的菌落增長直徑(mm)-處理的菌落增長直徑(mm)]/[對照的菌落增長直徑(mm)]×100％。

以試驗中設定的濃度對數為橫坐標(z)，抑制率幾率值為縱坐標(y)，求出各藥劑對供試病菌的毒力回歸曲線方程y=a+bx、相關系數r以及有效抑制中濃度(EC₅₀)。最后根據EC₅₀值，分析比較不同殺菌劑對供試病菌菌絲生長的影響。

1．4．2 供試藥劑對4種病菌分生孢子萌發的影響

采用瓊膠平板法測定藥劑對病菌分生孢子萌發的影響。將各藥劑分別加入到滅菌冷卻至50℃左右的水瓊膠培養基(瓊脂2％，蔗糖1％)中，制成濃度為1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的帶毒瓊膠平板，并設不加藥劑的瓊膠平板為對照。待瓊膠平板完全凝固后，以移液槍取200#L孢子懸浮液加入平板中，用曲玻棒涂抹均勻，置于(25±1)℃下黑暗培養10～12 h。待對照孢子萌發率超過90％以上時，在顯微鏡下(10×10倍)檢查各處理平板孢子萌發數，每處理計數200個以上孢子。與空白對照比較計算各藥劑對病菌分生孢子萌發的抑制率，分析比較不同殺菌劑對供試病菌分生孢子萌發的影響。

2 結果與分析

2．1 對病菌菌絲生長的影響

供試10種藥劑對5種鏈格孢屬病原真菌菌絲生長的毒力測定結果見表1，從表中可見，異菌脲、腐霉利、咪鮮胺、苯醚甲環唑、啶菌惡唑等5種藥劑對病菌菌絲生長的抑制活性均較高，除異菌脲對番茄早疫病菌的EC₅₀為1.28ug/mL外，其余EC₅₀均小于1ug/mL，且這些藥劑對不同種的鏈格孢屬病菌的活性差異較小，EC₅₀均相差在5倍以內。此外，結果也表明生產上應用較多的苯并咪唑類殺菌劑多菌靈對這類病菌的活性較差，EC₅₀均大于100 ug/mL。盡管三唑酮、咪鮮胺、苯醚甲環唑等均為病菌麥角甾醇生物合成抑制劑，但它們對鏈格孢屬病菌的活性存在差異，后兩種藥劑均表現出了較高的活性。

2．2 對分生孢子萌發的影響

由于本研究所用蘋果斑點落葉病菌菌株的分生孢子產生量較低，因此僅測定了其余4種鏈格孢屬真菌的分生孢子萌發對10種藥劑的敏感性。結果表明(表2)，不同藥劑對同一種鏈格孢真菌分生孢子萌發的抑制活性不同，但同一藥劑對不同種鏈格孢病菌的活性相近。在藥劑濃度為100ug/mL時，百菌清對4種供試病菌分生孢子萌發的相對抑制率達到了94.28％～100％，抑制作用最強，其次是醚菌酯(78.02％～91.79％)、嘧菌酯(78.04％～89.95％)、啶菌惡唑(69.50％～88.39％)、腐霉利(68.00％～85.72％)，抑制作用較低的殺菌劑有異菌脲(48.70％～73.79％)、咪鮮胺(14.72％～75.63％)、苯醚甲環唑(15.45％～51.93％)，抑制作用最低的殺菌劑有三唑酮(1.74％～20.84％)和多菌靈(5.67％～12.35％)。在藥劑濃度為10ug/mL時，除百菌清、醚菌酯、嘧菌酯、啶菌惡唑4種殺菌劑仍具有較高的相對抑制率外，其余6種殺菌劑的相對抑制率均低于25％。在藥劑濃度為1/ug/mL時，百菌清對4種供試病菌分生孢子的萌發仍有80％以上的相對抑制率，醚菌酯和嘧菌酯則具有20.01％～52.09％的相對抑制率，啶菌惡唑僅有11.00％～25.23％的相對抑制率。

3 討論

本文所選用的5種供試植物病原菌所致病害均是生產上發生普遍、危害嚴重的鏈格孢屬病菌，如番茄早疫病又稱輪紋病，全國各地普遍發生，是番茄重要病害之一，發病嚴重時引起落葉、落果和斷枝，對產量影響很大，常年減產20％～30％，嚴重時達50％以上，甚至絕產；煙草赤星病是煙葉成熟后期重要的葉部病害，是煙草生產上威脅最大的病害之一，對煙草的產量和品質均造成嚴重影響，自1892年首次報道煙草赤星病以來，曾幾次給世界煙葉生產帶來巨大的經濟損失。對這類病害的防治目前均缺乏有效的抗病作物品種，主要依賴于化學藥劑進行防治，過去防治此類病害使用的藥劑主要有二硫代氨基甲酸酯類、芳烴類、二甲酰亞胺類等，常見的品種如代森錳鋅、百菌清、菌核凈、異菌脲、腐霉利等，但這些藥劑防治效果較好，治療效果差，而且這些殺菌劑已經使用了十幾年甚至幾十年，有些品種的施用量已經達到原有用量的數倍，抗藥性問題嚴重，這不僅提高了農業生產成本，而且由于過量用藥導致環境污染嚴重，危害生物安全。因此，研究使用新型高效、廣譜、作用機理不同、結果新穎的殺菌劑以及科學合理使用現有藥劑防治這類病害是生產上亟待解決的問題。

本研究表明，同一藥劑對不同種類的鏈格孢屬植物病菌的活性相近，因此，生產上在選擇藥劑防治此類病害時可相互借鑒用藥方案，但不同種的鏈格孢病菌由于用藥歷史和防治水平的差異，其抗藥性發生狀況也不盡相同。結果表明苯并咪唑類的多菌靈無論對菌絲生長還是孢子萌發的活性均較低；百菌清雖然對菌絲生長的抑制活性較差，但對孢子萌發的抑制活性高，其為多作用位點保護性殺菌劑，使用多年來未出現抗藥性問題，建議與其他高效內吸性藥劑混配使用防治這類病害；異菌脲和腐霉利均為二甲酰亞胺類殺菌劑，均對菌絲生長的抑制活性較高，但對孢子萌發的抑制作用較低，且內吸性較差，抗性風險較高；三唑酮、咪鮮胺、苯醚甲環唑等均是麥角甾醇生物合成抑制劑，均對孢子萌發的抑制活性較差，但后面兩種藥劑對菌絲生長抑制活性較高；啶菌惡唑是我國自主研制的新穎結構殺菌劑，對菌絲生長的抑制活性較高，對孢子萌發也有一定的抑制活性；醚菌酯和嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，均是新近開發的線粒體呼吸抑制劑，對病菌孢子萌發活性較高，但由于在離體培養基平板上沒有抑制病菌旁路呼吸代謝途徑的物質，因此降低了其對菌絲生長的抑制活性，而在植物體內存在抑制旁路氧化酶(AOX)的(類)黃酮類物質，因此在植物活體上的活性較高，已有報道其在防治番茄早疫病及蘋果斑點落葉病具有優良的防治效果，但已有報道病菌對甲氧基丙烯酸酯類藥劑產生了抗性問題。因此，生產上可根據這些藥劑的活性和作用特點，輪換或混配使用用于鏈格孢屬真菌病害的防治，以達到理想的防治效果，并能延長這些藥劑的使用壽命。