Ｃａ²⁺對角質形成細胞增殖與分化調控的作用研究

[摘要]目的：探討胞外Ca²⁺對人角質形成細胞(HKC)的增殖與分化的調控作用，為組織工程皮膚的研制提供依據。方法：HKC體外培養，應用形態學、免疫細胞化學、MTT等方法檢測胞外Ca²⁺對HKC增殖與分化的影響，并利用鈣通道阻滯劑SKF 96365來研究其作用的可能途徑。結果：Ca²⁺為0.5mmol/L時，HKC呈單層生長，免疫細胞化學顯示HKC呈低分化狀態，當Ca²⁺為1mmol/L與1.5mmol/L時，細胞在3天后出現復層生長，免疫細胞化學顯示細胞K19角蛋白表達減少，Ca²⁺為2.0mmol/L時表現出一定的細胞毒性作用，SKF 96365可逆轉Ca²⁺的促增殖與分化作用。結論：胞外Ca²⁺在一定范圍內具有促HKC分化與增殖的作用，并且該作用可以被SKF 96365所阻滯。

[關鍵詞]Ca²⁺；角質形成細胞；組織工程；鈣通道阻滯劑

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2007）09-1181-03

The regulative effect of Ca²⁺ on proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes

SUN Qiang，CHAI Jia-ke，LIANG Li-ming，YANG Hong-ming，DU Jia-mei，WANG Li-huan

(Department of Plastic and Burns Surgery，First Affiliated Hospital，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100037，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the regulative effect of Ca²⁺ on growth and differentiation of keratinocytes which is the base of tissue engineering skin.MethodsKeratinocytes were cultured with H-KGM contained different levels of Ca²⁺ or Ca²⁺ entry blocker. The result were detected by morphology ， immunocytochemistry and MTT assay for two weeks.ResultsThe cell were in monolayer in H-KGM at level of 0.5mmol/L Ca²⁺，However， as concentration of Ca²⁺ was 1mmol/L or 1.5mmol/L， cell grown up rapidly and became stratum after 1-3d of culture， the expression of keratin 19 decreased. We also found the cytotoxicity of 2.0mmol/L Ca²⁺， this effect was markly suppressedby Ca²⁺ entry blocker.ConclusionCa²⁺ can promote the proliferation and differentiation of kerationcyte， and this effect can be depressed by the Ca²⁺ entry blocker.

Key words: Ca²⁺ Keratinocyte;tissue engineer;Ca²⁺ entry blocker

隨著組織工程研究工作的不斷深入，更多的學者[1]認識到目前組織工程研究工作的重點是如何解決種子細胞的調控問題。HKC是構建組織工程皮膚重要的種子細胞，研究表明，HKC的增殖與分化是受多因素調節的復雜過程。Ca²⁺作為體內活躍的陽離子，參與了機體多種生理性與病理性活動，有資料[2]顯示，Ca²⁺具有促表皮細胞增殖與分化的作用，但Ca²⁺對HKC的調節作用與其劑量之間具體的關系，以及鈣通道阻滯劑對這種調節作用的影響仍存在眾多爭議。本文以體外培養的HKC為研究對象，觀察Ca²⁺對其增殖與分化的影響，旨在為組織工程皮膚的研制與應用奠定一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象：HKC取自包皮環切術與燒傷整形植皮手術剩余皮片，患者知情同意。

1.1.2 試劑與藥品：細胞培養所采用的H-KGM培養基、Dispase酶與胰酶均為Gibco公司產品，K19免疫組化試劑盒購于中杉金橋生物技術有限公司，MTT購于sigma公司，SKF 96365為Biomol Research Lab Inc（USA）產品。

1.2 方法

1.2.1 HKC培養：參照《細胞培養》[3]中的方法并加以改進，取手術患者剩余皮膚，去除多余的皮下組織與部分真皮，剪成皮條，置于0.25%的dispase酶中4℃過夜消化；分離表皮與真皮，將剝離的表皮剪碎后置于0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA混合液中37℃消化5min；終止消化后用尼龍篩網過濾，離心后收集細胞，加入H-KGM，接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2孵箱中培養及傳代。

1.2.2 Ca²⁺對HKC體外生長的影響：①形態學觀察：將第3代細胞按1×105接種24孔培養板，當其達到對數生長期時，按下列分組：對照組、低鈣組、中鈣組、高鈣組、極高鈣組分別將培養基更換為含Ca²⁺濃度為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L的H-KGM，并設置阻滯劑對照組與鈣通道阻滯劑組，即SKF 96365(10μmol/L)組與SKF 96365(10μmol/L)+Ca²⁺(1.0mmol/L)組，繼續培養2周，分別在1、2、4、6、8、11、14天行形態學觀察并記錄。②MTT法：將第3代HKC按1×103接種于96孔培養板（200μl/孔），當其達對數生長期時，按上述分組更換培養基，每組6孔，另外設空白對照，在第7天加入MTT后孵育4h，小心吸去上清液，加入150μl DMSO，震蕩10min，于波長490處讀取吸光度（OD值）平均值，計算細胞生存率： 細胞生存率=(OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.2.3 細胞組織化學：將表皮細胞接種于清潔消毒的蓋玻片上培養24h，按上述分組更換培養基后繼續培養，繼續培養48h后按免疫組化試劑盒說明書進行操作，同時設立陰性與陽性對照組，

1.2.4 統計學分析：檢測數據采用單因素方差分析及t檢驗進行統計學處理，統計軟件為SPSS10.0。

2結果

2.1 形態學指標(如圖1)：在無鈣、低鈣、及存在SKF 96365條件下，細胞為單層鋪路石樣生長，以小細胞為主，細胞邊緣清晰，除無鈣條件下細胞增殖緩慢甚至停滯外，低鈣組與鈣通道阻滯劑組細胞增殖活躍，偶見分化變異的大細胞，低鈣組在6天后細胞達100%融合，細胞內顆粒增多，局部細胞出現崩解現象。中鈣組與高鈣組在處理2～3天即出現改變，細胞出現成簇樣生長現象，個別區域細胞輪廓不清，處理3天后在某些區域細胞出現復層生長現象，復層區域呈山丘樣生長，7天后細胞廣泛融合，邊緣不清或消失，復層區域相互連接，形成廣泛的復層結構。極高濃度組在處理1天后細胞即發生形態變化，與中鈣組與高鈣組處理2～3天相似，但2～3天后細胞即出現廣泛融合，細胞邊界消失，結構不清，部分細胞核崩解，處理4天后60%～70%細胞死亡或凋亡。

圖1不同濃度Ca²⁺對體外培養HKC生長的影響（光鏡×100倍）（A：在無鈣H-KGM條件下培養5天后，HKC單層生長，克隆形成率較低，細胞基本不增殖； B：含0.5mmol/L Ca²⁺ 的H-KGM培養5天后，HKC單層生長，形成鋪路石樣外觀；C：1mmol/LCa²⁺ 的H-KGM處理3天的HKC，局部細胞出現山丘樣的復層結構； D：2mmol/LCa²⁺的H-KGM處理4天后顯示HKC 細胞廣泛壞死脫落）

2.2 細胞組織化學(如圖2)：與對照組比較，中鈣組與高鈣組細胞表達K19角蛋白數量明顯減少，陽性細胞率與對照組比較具有顯著性差異。極高鈣組細胞陽性率與低鈣組比較差異無顯著性，但細胞總量減少，鈣通道阻滯劑組、阻滯劑對照組與對照組比較，無顯著性差異。

2.3 MTT結果（如圖3）：MTT結果顯示，無鈣條件下，細胞增殖緩慢，甚至停滯，低鈣組、中鈣組與高鈣組的細胞生存率分別為409.62 %、442.31%、396.15%，與對照組比較P<0.01，有顯著性差異。低鈣組、中鈣組、高鈣組之間相互比較，P>0.05，差異無顯著性。在極高鈣條件下，細胞生存率為30.77%，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。阻滯劑對照組與鈣通道阻滯劑組的細胞生存率分別為88.46%與176.92%，阻滯劑對照組與對照組比較 (P>0.05)，鈣通道阻滯劑組與中鈣組比較（P<0.01）具有顯著性差異。

3 討論

3.1 HKC是皮膚組織工程重要的種子細胞，研究其增殖分化的調控機制對于人工活性皮膚的研制具有十分重要的意義。在生理條件下，表皮細胞的增殖與分化是一個涉及多種內外因素協同作用的復雜過程。Ca²⁺是機體內具有活躍生物活性的陽離子，參與多種生理病理活動，如遞質釋放、心肌電位形成、信號傳導等，同時有研究顯示，Ca²⁺對多種細胞的增殖與分化具有十分重要的調節作用。

3.2本研究發現，Ca²⁺在一定范圍內具有促HKC增殖作用，并且表現出一定的劑量-效應依賴關系，當Ca²⁺在0～1.0mmol/L之間變化時，細胞的增殖活力隨著Ca²⁺的增加而升高，當Ca²⁺達1.5mmol/L時，細胞的增殖活力有所下降，但與中鈣組比較無顯著性差異，顯示在該濃度范圍細胞增殖活性達最高值并處于穩定狀態。但當Ca²⁺達到2.0mmol/L時，細胞的增殖活力迅速下降，低于對照組，兩者之間具有顯著差異，提示在該濃度下，細胞可能因高鈣負荷而出現細胞死亡或凋亡，從而顯示出一定的細胞毒性作用。

3.3 本研究采用表皮干細胞特異的表面抗原K19[4]為標志，研究Ca²⁺對HKC分化的影響，該表面抗原在低分化細胞呈強陽性表達，而在分化細胞表達弱或不表達。本研究發現，當Ca²⁺在0～0.5mmol/L范圍時，K19表達為強陽性或陽性，提示在該濃度條件下大多HKC仍處于未分化狀態。而當Ca²⁺在1.0～1.5mmol/L范圍時，大多HKC已進入終末分化狀態。本研究還發現當Ca²⁺達2.0mmol/L時，大部分HKC處于低分化狀態，可能是由于細胞凋亡或死亡，而使其處于假性的“未分化”的狀態。

3.4 如何在獲得足夠數量種子細胞的同時保持一定比例的表皮干細胞，是組織工程皮膚構建過程中十分重要的問題[5]，雖然近幾十年以來，國內外一些實驗室已經能夠大量的進行HKC的體外擴增，但HKC在培養過程中易于老化，是亟待解決的問題。本研究顯示，當Ca²⁺為0.5mmol/L時，HKC具有較強的增殖能力，并可保持大量細胞的處于未分化的干細胞狀態，而在1.0～1.5mmol/L條件下，雖然HKC增殖能力較強但干細胞的比例卻明顯下降，在無Ca²⁺條件下，雖然細胞大多處于未分化狀態，但HKC增殖停滯。該結果提示，Ca²⁺為0.5mmol/L時是維持種子細胞HKC擴增較理想的條件。

3.5 HKC分層是表皮屏障功能形成的重要環節，而HKC的分層與其正常的分化密切相關。在體外條件下，通過液氣面培養[6]和改變Ca²⁺濃度可誘導HKC出現分層，本實驗顯示，當鈣離子濃度大于1.0mmol/L時就可誘導HKC的分層現象，表明提高培養基中Ca²⁺是誘導HKC體外分層的又一途徑。研究表明[7]，HKC分層與KC間橋粒的形成及粘附分子E-cadherin在HKC胞膜處的表達密切相關，已有資料顯示[8]，Ca²⁺能夠促進HKC間橋粒的形成，并增加E-cadherin在HKC表面的表達，因此，本實驗中Ca²⁺誘導HKC的分層作用可能與Ca²⁺的此項功能有關。

3.6 在全層組織工程皮膚的使用過程中，常發生組織工程皮膚表皮或創面殘余的表皮層脫落的現象，這一方面與創面營養不良有關，另一方面，創面局部特殊的離子環境也可能參與其中，創面局部酸性條件引起的高Ca²⁺環境可能誘導HKC迅速老化，從而導致表皮干細胞的數量減少，使皮膚移植失敗或創面遷延不愈，本研究發現SKF 96365能夠逆轉Ca²⁺誘導產生的細胞增殖與分化作用，提示鈣通道阻滯劑的應用可能有助于該問題的解決。另外有研究顯示，電壓依賴性鈣通道阻滯劑不能抑制Ca²⁺對HKC的調節作用[9]，而SKF 96365[10-11]是一種非特異的對受體依賴性和電壓依賴性的鈣通道都具有阻滯作用的Ca²⁺通道阻滯劑，這說明Ca²⁺對HKC調控作用可能是通過受體依賴性鈣通道發揮作用的，其確切機制還有待進一步探討。

3.7 本試驗結果提示，含0.5mmol/L Ca²⁺的H-KGM培養基是進行HKC擴增較為理想的培養條件，而1.0～1.5mmol/L Ca²⁺條件是促進復層表皮形成的重要條件，此發現對于組織工程人工皮膚的研制與開發具有重要意義，另外本研究還發現，鈣通道阻滯劑SKF 96365能夠抑制上述的Ca²⁺引起的HKC增殖與分化的調控作用，其機制和意義還有待進一步探討。

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[收稿日期]2007-06-05 [修回日期]2007-08-29

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”