核酸疫苗

摘 要 核酸疫苗自出現(xiàn)以來，就以高效、持久、廣譜、簡便、廉價、無致病性等特點，作為一種新型的疫苗而得到廣泛的研究和應(yīng)用。核酸疫苗不僅有預(yù)防疾病的作用，同時還具有治療疾病的作用。在不久的將來，核酸疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段。

關(guān)鍵詞 核酸疫苗 抗原基因 免疫機制

中圖分類號 Q-3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 E

20世紀(jì)90年代初，一系列關(guān)于注射外源基因在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的報道揭開了核酸疫苗研究的序幕。由于核酸疫苗可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，并且對不同亞型的病原體具有交叉防御作用，同時又具有安全、可靠、生產(chǎn)方便等優(yōu)點，故被認(rèn)為是繼減毒、滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表面載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動植物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。

1 核酸疫苗的構(gòu)建

核酸疫苗的構(gòu)建是通過重組DNA技術(shù)，將抗原基因定向插入哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，篩選并獲得重組克隆的過程，可以分為以下4個過程：抗原基因和載體的制備；抗原基因和載體的連接；重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞；重組分子的篩選與鑒定。

1.1 抗原基因和載體的制備

抗原基因只有在正確的方向，正確地讀框插入載體中的啟動子下游才能被表達(dá)。因此，在核酸疫苗的構(gòu)建過程中必須保證抗原基因的定向插入或插入載體后鑒定抗原基因的方向。其中，抗原基因的定向插入是較為直接和有效的方法。要做到抗原基因的定向插入，必須是抗原基因兩端分別帶有各不相同的限制內(nèi)切酶的黏性末端。而載體兩端也需帶有能與抗原基因兩端分別互補配對的黏性末端；如抗原基因兩端的限制酶位點與載體不符，可通過克隆載體更換限制酶位點或設(shè)計需要限制酶位點的PCR引物，做PCR來達(dá)到目的。

1.2 抗原基因和載體的連接

1.2.1 全同源粒性末端連接

DNA插入片斷與載體用相同的內(nèi)切酶切開，兩者的兩端具有相同的抗原基因和載體的連接黏性末端，這種連接稱為全同源黏性末端連接。

1.2.2 定向克隆

使外源DNA片段定向插入到載體分子中的克隆方案稱為定向克隆。定向克隆是用2個不同的限制性內(nèi)切酶切割目的DNA分子，產(chǎn)生2個不同黏性末端來實現(xiàn)的。

1.2.3 平末端連接

有些限制性內(nèi)切酶切割靶DNA的2條鏈不產(chǎn)生突出端（粒端）而產(chǎn)生平末端（平端）。平端之間的連接效率比粒端之間的連接效率變低，但因平端連接具有普適性，有時比較有用。例如，限制酶HaeⅢ產(chǎn)生的平端不僅能與HaeⅢ或其他限制酶產(chǎn)生的平端連接，而且能與補平或削平后的其他內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的3'-與5'-突出端連接。

1.3 重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞

在核酸疫苗構(gòu)建過程中，操作的載體主要是質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化。而將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。

1.4 重組子的篩選與鑒定

重組子的篩選與鑒定可以在各個水平上進行，例如DNA水平、蛋白質(zhì)水平及基因所能表現(xiàn)的功能水平。DNA水平有酶切、PCR初步鑒定、核酸雜交和DNA序列分析。蛋白質(zhì)水平有插入失活雙抗生素對照篩選和插入失活、Lacz’基因的藍(lán)白斑篩選。

2 核酸疫苗的免疫

2.1 免疫的機制

質(zhì)粒DNA被導(dǎo)入細(xì)胞后，得到抗原編碼基因。即在質(zhì)粒所帶強啟動子的作用下表達(dá)抗原基因蛋白，隨后被降解成8～12個氨基酸的短肽，這些短肽含有不同的抗原表位。來源于胞液和囊液的抗原表位則分別與MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，并被遞至到細(xì)胞表面，與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的短肽激活CD8+T細(xì)胞（CTL），與MHC-Ⅱ類結(jié)合的短肽則激活CD4+T細(xì)胞（T輔助細(xì)胞）。而分泌到細(xì)胞外的抗原則為帶有抗體的B細(xì)胞捕捉，并在T輔助細(xì)胞分泌淋巴因子的刺激下轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，大量分泌抗體。

2.2 抗免疫接種的途徑

抗原的表達(dá)是決定于被細(xì)胞攝取的DNA量以及抗原基因在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)水平和持續(xù)時間。被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量取決于核酸疫苗的劑量和劑型核細(xì)胞種類。同時，由于在某一點的DNA攝取劑量與該點的注射量并非成正比，因此，在考慮免疫接種的總劑量時還應(yīng)將免疫劑量分?jǐn)?shù)個點連續(xù)接種以增加攝取量。

目前，核酸疫苗的免疫接種途徑有肌肉注射、基因槍介導(dǎo)的皮內(nèi)或皮下導(dǎo)入、黏膜表面涂布、靜脈注射和腹腔注射。其中肌肉注射是目前應(yīng)用的最廣泛且被證明是十分有效的免疫接種途徑，靜脈注射的保護效率也達(dá)83％。

3 核酸疫苗的特點

3.1 激發(fā)機體全面的免疫應(yīng)答

其保守抗原的保護性免疫應(yīng)答對不同亞型的病原體有交叉抵御作用，能聯(lián)合免疫，即可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個質(zhì)粒中或?qū)⒉煌乖虻亩喾N質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價核酸疫苗。

3.2 免疫效果好、免疫應(yīng)答持久

核酸疫苗能在個體內(nèi)長期存在并持續(xù)表達(dá)低水平的抗原蛋白，無須后續(xù)免疫注射而能夠誘導(dǎo)持續(xù)的免疫效應(yīng)達(dá)一年以上。與普通蛋白疫苗不同，核酸疫苗能在自身細(xì)胞中產(chǎn)生外源性蛋白，這種蛋白交織在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更像天然分子，其遞生過程與自然感染十分相似。核酸疫苗表達(dá)的接近天然構(gòu)象，抗原性強。因此，這樣的免疫原將含有在構(gòu)象上相關(guān)的表位，誘導(dǎo)產(chǎn)生對應(yīng)于天然抗原的免疫應(yīng)答。另外，核酸疫苗對已有免疫力的個體接種仍可起作用。

3.3 導(dǎo)致細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞激活而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫

傳統(tǒng)疫苗中只有活疫苗能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，但活疫苗存在著恢復(fù)感染的危險，尤其在免疫抑制或營養(yǎng)不良的個體中以及存在其他病毒感染的情況下。核酸疫苗與減毒活疫苗和載體活疫苗一樣引起CTL應(yīng)答，但卻不存在后兩者毒力回升的危險，也不存在散毒現(xiàn)象。

3.4 方法簡便、價格低廉、便于儲存和運輸

核酸疫苗僅需要在細(xì)菌中生產(chǎn)，構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，與普通疫苗相比，核酸疫苗的制作省去了抗原提取和純化等繁瑣耗時的過程，核酸疫苗用量少，干燥的DNA在室溫下相對穩(wěn)定，不需要冷藏設(shè)備，比其他疫苗更經(jīng)濟。

4 核酸疫苗的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)科學(xué)迅速發(fā)展的今天，核酸疫苗可以克服所選用的抗原不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)，而可以類似于病原微生物感染方式產(chǎn)生抗原，這種天然構(gòu)系的抗生素原能按正常途徑加工處理并提呈給免疫系統(tǒng)，從而激發(fā)免疫應(yīng)答。目前，常用的核酸疫苗有乙型肝炎核酸疫苗、艾滋病核酸疫苗、流感病毒核酸疫苗、瘧疾核酸疫苗、利什曼病核酸疫苗、豬帶絳蟲病核酸疫苗、腫瘤核酸疫苗等。

目前，核酸疫苗不僅用于感染性病原體的防治，并且在自身免疫性疾病等與免疫相關(guān)的疾病中也能發(fā)揮出重要作用。由于核酸疫苗引發(fā)TH2性免疫應(yīng)答能對自身免疫性疾病防治產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。研究人員做了用核酸疫苗預(yù)防實驗室自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的嘗試，并取得成功。因此，核酸疫苗在治療TH1免疫反應(yīng)介導(dǎo)的自身免疫性病，如多發(fā)性硬化、青少年型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，有廣泛的應(yīng)用前景。

5 核酸疫苗的潛在缺陷

5.1 核酸疫苗導(dǎo)入與致癌的可能性

核酸疫苗是介于生物治療劑與基因治療劑產(chǎn)品之間的療法。外源基因?qū)牒螅锌赡芗せ顑?nèi)源性原致癌基因，或者使宿主抗癌基因失活，這一可能性不容忽視。目前檢查的1 800余種核酸疫苗中，雖然沒有發(fā)現(xiàn)外源基因與宿主染色體整合的證據(jù)，但核酸疫苗真正應(yīng)用于人體之前，這個問題必須加以解決，如果核酸疫苗DNA與宿主染色體發(fā)生整合，可能會發(fā)生難以預(yù)料的嚴(yán)重后果。

5.2 產(chǎn)生抗DNA抗體

目前對于抗DNA抗體的產(chǎn)生原因有2種觀點：一是有B淋巴細(xì)胞增生而產(chǎn)生，二是抗原特異性選擇引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞活化而產(chǎn)生。

5.3 持續(xù)表達(dá)外源抗原可能產(chǎn)生不良后果

從理論上講，外源抗原表達(dá)的時間越長，產(chǎn)生不良后果的可能性越大?？赡墚a(chǎn)生的不良后果包括：產(chǎn)生耐受性、自動免疫、過敏反應(yīng)、超免反應(yīng)等。另外還有2個不容忽視的后果：一是持續(xù)低水平的表達(dá)的抗原可能會被血中的抗體清除，不能引起足夠的免疫答應(yīng)；二是持續(xù)高水平的表達(dá)外來抗原，可能引起機體超免反應(yīng)，最終導(dǎo)致機體免疫抑制而易感染其他病原體。