黃芩苷和川芎對ＵＶＢ輻射皮膚成纖維細胞的影響

[摘要]目的：研究中藥活性成分黃芩苷，川芎對中波紫外線(UVB)輻射損傷成纖維細胞保護作用的影響及相關作用機制。方法：采用0mJ/cm²，30mJ/cm²，60mJ/cm²，90mJ/cm²劑量UVB照射培養的原代人皮膚成纖維細胞，同時加入黃芩苷和川芎干預處理，觀察細胞損傷的形態學變化，以MTT法檢測細胞活性，以酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測IL－10，IL－12和TNF－a的分泌量。結果：UVB照射后，細胞損傷程度與照射劑量呈正相關，增殖活性下降；此外，UVB照射后IL－10等細胞因子分泌增加，而加入所試中藥干預可明顯抑制細胞損傷和相關細胞因子分泌。結論：黃芩苷、川芎有一定的光保護作用，抑制炎癥細胞因子IL－10，IL－12，TNF－a的分泌可能是其減輕UVB光損傷的機制之一。

[關鍵詞]紫外線；成纖維細胞；黃芩苷；川芎；IL－10；IL－12；TNF－a；光損傷；光保護

[中圖分類號]Q256 [文獻標識碼]A [文章編號] 1008－6455(2007)07－0977－03

紫外線的輻射(包括UVA，UVB)是導致人體皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的主要因素。高紫外線暴露人群皮膚老化危險性比低暴露人群高一倍，老化發生提前10年。皮膚光老化不僅有損于人的美容，而且與皮膚病的發生有著病因學的聯系。中波紫外線(UVB)輻射可引起皮膚老化的發生，外觀出現干燥，粗糙，失去彈性，產生皺紋，皮膚的彈性蛋門和膠原蛋白的含量出現變化。成纖維細胞是UVB敏感的靶細胞，經UVB輻射后，可以釋放一些具有免疫調節作用的細胞因子，引發一系列的信號傳導，最終可以導致皮膚老化的發生。

IL－10，IL－12，TNF－a均是由皮膚成纖維細胞合成的土要細胞因子，參與紫外線引起的皮膚炎癥反應過程及免疫調節，并在紫外線介導的細胞凋亡中起著重要作用。傳統中藥黃芩中的活性成分黃芩苷，及川芎等可抑制紫外線照射所致的皮膚脂質過氧化，防治皮膚的光損傷。本文通過體外培養人原代表皮成纖維細胞，用一定劑量的UVB照射，并分別以所選中藥處理，旨在證實所選藥物可緩解UVB照射的損傷作用。

1 材料和方法

1．1 材料：健康青少年男性包皮環切術切除的包皮，生理鹽水，0.5％的中性蛋白酶(sigma公司)，表皮消化液(0.25％的胰蛋白酶和0.1％的EDTA，Amresco公司)，DS培養基(DMEM加10％小牛血清，GIBCO公司)，四甲基偶氮唑(sigma公司)，黃芩苷(中國藥品檢驗所)，川芎(中國藥品檢驗所)，96孔培養板。

1．2 方法

1．2．1 原生代成纖維細胞培養：將包皮剪成0.5cm×0.5cm的皮片，碘伏浸泡5min后用含青霉素(10萬u/L)和鏈霉素(100mg/L)的生理鹽水漂洗3次，加入0.5％中性蛋白酶，在4℃下消化18－20h，將皮片的真、表皮進行分離，真皮部分以表皮消化液在37℃下消化5min后，加入DS培養基，輕輕吹打，200目尼龍網過慮，過濾后的細胞液1500r/min離心5min，棄去上清，加入DS培養基繼續培養。

以0.25％胰酶和0.02％EDTA消化上述細胞，調整其密度為1×10⁶/ml定量接種于96孔板，培養24h，待其貼壁后用于細胞活性檢測和細胞因子水平檢測。

1．2．2 實驗分組：實驗分為量效組和加藥組，每組均設OmJ/cm²為對照組，量效組接受30mJ/cm²，60mJ/cm²，90mJ/cm²UVB照射后孵育24h，加藥組加入黃芩苷、川芎預處理后，接受30mJ/cm²，60mJ/cm²及90mJ/cm² UVB輻射孵育24h，根據預試驗結果選用黃芩苷濃度為15μg/ml，川芎濃度為50μg/ml。

1．2．3 紫外線照射：接種于培養板中的細胞生長至70％融合時給予UVB照射，照射前先棄去各孔細胞培養液，PBS洗二遍后加少量PBS覆蓋底面，置紫外線輻射儀(上海sigma技術有限公司生產，發射峰310nm)照射，細胞與燈管距離15cm，然后棄覆蓋液換回DMEM培養基。

1．2．4 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖活性：照射細胞后24h向每100μl培養基中加入20μl濃度為5mg/ml的MTT，孵育4h后棄上清，加入120μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫震蕩15min，用128c酶標儀(奧地利CliniBio公司)在570nm波長處測吸光度OD值，空白試劑孔調零，讀取吸光度值。

1．2．5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞因子分泌量：上述細胞照射后24h收集細胞培養上清液，凍存于－70℃冰箱。使用ELISA試劑盒(BPBBiomedical，Inc)嚴格按說明書操作。簡要步驟：離心檢測標本取上清和標準品一起加入相應孔中，(每個標本設3個復孔)，加入生物素化抗體工作液孵育45min，洗板后加入酶標記液孵育45min，洗板后加入底物孵育15min，然后加入終止液，混勻即用酶標儀測OD450值。

1．2．6 統計方法：以spss11.0統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析，當P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 UVB對成纖維細胞光損傷的形態學影響：成纖維細胞在接受不同計量(3OmJ/cm²，60mJ/cm²，90mJ/cm²)UVB照射后24小時，細胞均受到不同程度的損傷，表現為細胞腫脹、細胞碎片增多且部分漂浮于培養液中。以90mJ/cm² UVB損傷作用最強，60mJ/cm²的損傷作用次之，30mJ/cm²則較弱。

2．2 UVB對細胞增殖活性的影響：量效組在接受照光后24小時檢測細胞活性，差異有統計學意義(P＜0.05)。加藥組中，OmJ/cm²組24h細胞活性檢測與對照組無明顯差異，表明所加藥物在該濃度對細胞活性無明顯影響。不同劑量UVB照射24h細胞活性下降，其下降幅度與UVB照射劑量相關，有顯著性差異。UVB加藥組處理的細胞活性均較UVB單純照射組有所恢復，其中在低劑量照射組恢復程度高于高劑量組照射組的恢復程度(表1)。

2．3 受試藥物及UVB對細胞因子分泌水平的影響：隨著UVB輻射劑量的增加(OJ/cm²、30J/cm²)、60J/cm²、90mJ/cm²)，成纖維細胞分泌IL－10，IL－12及TNF－a的量也逐漸增多。加入工具藥物干預后，黃芩苷和川芎在每個UVB劑量水甲均可抑制上述細胞因子的分泌(P＜0.05)(表2)：

3 討論

來自日光的紫外線對皮膚曬傷、皮膚炎癥、皮膚老化與皮膚癌的發生有重要影響。到達地球表面引起人皮膚損傷的紫外線包括UVB(280－315nm)和UVA(315－400nm)，而同等劑量下UVB對皮膚的損傷強度比UVA約大1000倍。成纖維細胞是真皮的主要功能細胞和結構基礎，是紫外線輻射的重要靶位之一。本試驗結果表叫UVB照射可損傷成纖維細胞，導致細胞成長受到抑制，且成纖維細胞的損傷程度與UVB照射的劑量呈正相關。

IL－10，IL－12，TNF-a是皮膚免疫系統的重要組成部分。IL－10來源于Th2細胞，可以抑制巨噬細胞和Th1細胞功能，下調細胞免疫應答，但可刺激B細胞增殖和產生抗體，上調體液免疫應答。IL－10是一個多效性細胞因子，具有免疫刺激和免疫抑制雙重作用，其免疫刺激作用主要是提高B細胞存活率，促進B細胞增殖、促進MHCⅡ類抗原表達以及抗體的分泌。IL－10的免疫抑制作用表現為能抑制Th1細胞的增殖和某些細胞因了的合成，其作用機制可能是IL－10作用于APC，誘導APC產生另一種細胞因子，改變細胞內信號的傳遞途徑，從而選擇性抑制某些細胞因子的mRNA轉錄，破壞了Th1/rh2的免疫平衡，發生偏向Th2細胞的免疫偏離，促進Th2細胞的體液免疫應答，抑制Th1及其介導的細胞免疫應答。IL－12米源于Th1細胞，是一個多功能的免疫調節因子，在調節T類細胞因子產生與維持Th1/Tc1應答優勢過程中具有重要作用。IL－12由單核細胞，B淋巴細胞產生，在免疫過程中介導Th1型免疫反應，可以促進Th1細胞的增埴分化，產生Th1細胞因子，抑制Th2細胞的增殖分化。IL－12還具有調節Th1與Th2細胞之間的平衡，可促使ThO/TCO細胞分化為Th1/Tc1細胞，促進Th1/Tc1細胞增殖和分化，誘導Th1/Tc1細胞產生大量的IFN－γ，而IFN－γ反過來又能促進IL－12大量產生。TNF－a是調控機體免疫反應的重要因子，可傳遞細胞間信息，調節細胞功能，具有抗腫瘤，引起炎癥反應和免疫調節作用。它與UVB輻射引起的皮膚損傷、炎癥反應、接觸超敏反應和細胞凋亡等密切相關。UVB照射后皮膚內的TNF－a主要由真皮成纖維細胞產生。我們研究了UVB對成纖維細胞細胞因子分泌的影響，結果提示UVB促進了IL－10，IL－12，TNF－a的分泌，分泌量與照射劑量相關，說明UVB導致的細胞損傷可能與三種細胞因子的分泌增加有著密切相關的聯系。

黃芩苷是中藥黃芩的活性成分，有吸收紫外線的作用。黃芩苷的主要藥用成分黃酮類具有抗炎，抗氧化等生物學效應，對紫外線引起的紅細胞膜氧化損傷有保護作用。川芎中的阿魏酸能有效抑制氧自由基產生，保護膜脂質小被氧化，防止DNA損傷發生，還可能抑制腫瘤細胞的增殖生長。本文的研究顯示川芎和黃芩苷可減輕UVB對成纖維細胞的損傷，提高細胞增殖活性，但隨著照射劑量增加，其抵抗損傷作用的能力減弱，說明其光保護作用是有限的。此外，兩種單體成分均可抑制UVB輻射引起的炎性細胞因子IL－10，IL－12，TNF－a分泌，與單純照光組相比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

綜上所述，UVB對體外培養的人皮膚成纖維細胞有損傷作用，表現為細胞受損、生長抑制，其損傷程度呈劑量依賴性。UVB可促進受照射的細胞分泌IL－10，IL－12，TNF－a。川芎和黃芩苷可減輕細胞損傷，部分恢復細胞活性而具有光保護作用，抑制炎性細胞因子IL－10，IL－12及TNF－a的分泌可能是減輕紫外線輻射損傷的機制之一。這些結果為開發天然光保護劑提供了理論依據和實驗數據參考，也為今后紫外線輻射引起皮膚損傷，中藥防護及其機制的進一步研究打下了基礎。