病理性瘢痕中結締組織生長因子的免疫電鏡觀察

[摘要]目的：研究結締組織生長因子(CTGF)在病理性瘢痕組織中的表達定位，以探討其在病理性瘢痕中的作用及與病理性瘢痕形成的關系。方法：分別留取正常皮膚2例、淺表性瘢痕3例、增生性瘢痕、增生性瘢痕邊緣正常皮膚、瘢痕疙瘩及瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚各5例組織標本，用特異性抗體作為標記物，用膠體金作示蹤物進行免疫電鏡觀察，觀察標記物所在位置，以了解在不同組織中表達水平的差異性。結果：CTGF在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚中的表達均明顯高于正常皮膚、淺表性瘢痕及增生性瘢痕邊緣正常皮膚。免疫電鏡標記顯示成纖維細胞細胞超微結構清晰，金顆粒呈團狀、點灶狀分布，特異性強，CTGF蛋白陽性標記主要位于粗面內質網(wǎng)，粗面內質網(wǎng)核糖體、膠原纖維、細胞外基質、橋粒連接、常染色質等部位也有表達。結論：CTGF與病理性瘢痕的形成有相關性，在其發(fā)病過程中可能發(fā)揮重要作用。

[關鍵詞]結締組織生長因子(CTGF)：病理性瘢痕；免疫電鏡；膠體金

[中圖分類號]R392.11 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0871－03

臨床上常見的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是皮膚對創(chuàng)傷、炎癥、燒傷應激的一種過度的皮膚纖維增生性疾病，其形成原因至今尚未完全探明。隨著研究的深入，人們漸漸認識到結締組織生長因子(connective tissue growth fac－tor，CTGF)與病理性瘢痕密切相關。闡明CTGF在病理性瘢痕中的表達特點、分布規(guī)律、病理性瘢痕中超微結構特點等一系列問題將對最終揭示瘢痕的形成機制等提供科學的依據(jù)。本實驗通過應用特異性抗體作為標記物，用膠體金作示蹤物進行免疫電鏡觀察，觀察標記物所在位置，以分析比較標記物在不同組織中表達水平的差異性，探討CTGF的表達與病理性瘢痕形成的相關性。

1 材料和方法

1．1 標本來源及實驗分組：瘢痕疙瘩的診斷參照1991年James標準，且均屬于增生期。病例入選標準還包括：2年內未接受藥物注射、放射或外科治療：1個月內未予任何外用藥治療；無系統(tǒng)疾病者。無局部皮膚病變。標本均來源于濰坊市人民醫(yī)院美容整形科。總共有標本15例，其中男6例，女9例：年齡18－48歲，平均(30±14)歲；病程1－20年，平均(5.28±4.02)年。瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例，淺表性瘢痕組3例，正常皮膚對照組2例(均取自健康個體軀干上部)。實驗分6組：NS組(正常皮膚組)、SS組(淺表性瘢痕組)、HS組(增生性瘢痕組)、HSN組(增生性瘢痕邊緣外正常皮膚組)和K組(瘢痕疙瘩組)、KN組(瘢痕疙瘩邊緣外正常皮膚組)。

1．2 主要試劑與儀器：兔抗人CTGF多克隆抗體、即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。lOnm膠體金標記羊抗兔IgG及山羊血清封閉液購自北京博奧森生物技術公司。電鏡為日本產H－7500型透射電鏡。

1．3 免疫電鏡膠體金標記：取新鮮各組標本各取5例組織，修成lmm³大小，0.25％戊二醛(0.1mol/L，pH7.4二甲砷酸鈉緩沖液配制)4℃固定2h，不經(jīng)鋨酸固定，常規(guī)脫水Epon812包埋，聚合(37℃：12h，45℃:24h)，70nm超薄切片撈于無支持膜的200目不銹剛網(wǎng)上。①10％H₂O₂，10mim雙蒸水3×2min；TBS(pH7.4，Tris－HCI緩沖液)，3×2min；②1:20的羊血清白蛋白封閉30mim③兔抗人CTGF多克隆抗體，1:50，4℃冰箱過夜；④室溫復溫1h，pH7.4TBS噴洗，5×3min；pH8.2TBS(含1％BSA)洗，3×2mim⑤10nm金標羊抗兔IgG，室溫2h；⑥pH8.2TBS洗，5×3mimpH 7.4TBS洗3×3mim⑦1％戊二醛固定15min，雙蒸水洗2次；⑦醋酸雙氧鈾10min，枸櫞酸鉛5min，復染。用TBS代替一抗作空白對照，其他步驟相同，透射電鏡觀察。

2 結果

膠體金標記的陽性信號為電鏡下所見的致密、規(guī)則、反差比較大的、高電子密度圓形或近圓形顆粒。陰性對照無此顆粒。

電鏡下：瘢痕與正常皮膚細胞超微結構清晰，保存良好。瘢痕超微結構顯示以成纖維細胞的改變最顯著，成纖維細胞數(shù)量多、細胞體積大、胞漿豐富，胞漿內有發(fā)達的細胞器，主要是大量擴張的粗面內質網(wǎng)。細胞核亦增大，核質豐富，核仁明顯。所有6組標本中均出現(xiàn)了膠體金標記CTGF陽性顆粒，金顆粒呈圓形，電子密度高而清晰。在表達定量指標上，與免疫組化中的表達結果基本一致(另文發(fā)表)。在表達定位指標上有所區(qū)別，在正常皮膚和淺表性瘢痕、增生性瘢痕邊緣正常皮膚組織中金顆粒表達較少，金顆粒呈點灶狀分布。在正常皮膚主要位于基底細胞中的粗面內質網(wǎng)，真皮乳頭層有散在少量表達；在淺表性瘢痕組織中表達亦較少，主要定位于基底細胞中的粗面內質網(wǎng)，在成纖維細胞粗面內質網(wǎng)及細胞外基質有散在少量表達；在增生性瘢痕邊緣正常皮膚組織中，金顆粒主要見于成纖維細胞粗面內質網(wǎng)，膠原原纖維及細胞外基質有散在少量表達。在瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚和增生性瘢痕組織中，膠體金顆粒表達明顯增多，金顆粒呈團狀、點灶狀分布，標記主要位于成纖維細胞粗面內質網(wǎng)，此外，粗面內質網(wǎng)核糖體、膠原原纖維、細胞外基質、橋粒連接、常染色質等部位也有表達，聚集的膠體金顆粒清楚可見，特異性強，最多的一團金顆粒達上百枚。空白對照組細胞內未見CTGF特異性金標顆粒。

3 討論

3．1 近年來國內外學者對病理性瘢痕的發(fā)病機制從細胞因了、微循環(huán)、免疫、膠原代謝、基因表達、細胞增殖及調亡、氧自由基等各方面進行了深入的研究，但是任何一個單的因素都不能完整解釋病理性瘢痕的發(fā)病機制，普遍的觀點認為病理性瘢痕是多種因素共同作用的結果。目前所知與外傷、燒傷、于術、感染、異物、機體局部膠原代謝失調、遺傳及局部免疫功能等多種因素有關。其中細胞因子是眾多學者研究的重點，深入研究相關因子，可能為最終揭示病理性瘢痕的發(fā)病機制和生物學治療提供依據(jù)。

3．2 CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，被視為轉化生長因子-β，(TGF-β，)的下游反應元件，它的上述作用已在多種纖維化疾病的研究中得到證實。在瘢痕形成過程的體內和體外實驗研究中，CTGF對成纖維細胞的分化增殖，具有很強的調控作用，而CTGF的異常高表達在瘢痕形成過程的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關鍵作用，已成為瘢痕形成過程新的研究熱點。在間允質細胞中CTGF可以快速選擇性的被TGF-β₂誘導。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β₂可以直接激活CTGF基因的轉錄，在CTGF的啟動子序列128－162的位置上存在著一個重要的TGF-β₂調控元件，后者的點突變可以導致TGF-β₂活性的完全喪失。故認為CTGF是TGF-β₂致纖維化作用的下游效應介質，能夠調節(jié)細胞外基質基因的表達。

3．3 本實驗用特異性抗體作為標記物，用膠體金作示蹤物進行免疫電鏡觀察，觀察標記物所在位置，發(fā)現(xiàn)CTGF主要定位于瘢痕成纖維細胞胞漿中的粗面內質網(wǎng)，這同免疫組化研究CTGF主要定位于成纖維細胞胞漿相一致。粗面內質網(wǎng)核糖體、膠原纖維、細胞外基質、橋粒連接等部位也有表達。也有定位于核內、常染色質。在正常皮膚中免疫組化見CTGF呈弱陽性表達，主要在表皮基底層細胞。而免疫電鏡下CTGF主要在基底細胞有陽性表達顆粒，在成纖維細胞胞漿中的粗面內質網(wǎng)僅有少量表達，這可能與CTGF在正常皮膚表達較弱有關。而在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕甚至在瘢痕疙瘩邊緣正常皮膚中表達均較正常皮膚、淺表性瘢痕、增生性瘢痕邊緣正常皮膚明顯增強，說明這些組織纖維增生活躍，該結果顯示瘢痕疙瘩與增生性瘢痕既有纖維增生活躍的共同特性，又有區(qū)別。增生性瘢痕邊緣正常皮膚與正常皮膚、淺表性瘢痕表達基本相同，預示其治療效果要明顯好于瘢痕疙瘩患者，這與臨床治療效果基本一致。CTGF陽性顆粒為何出現(xiàn)在粗面內質網(wǎng)內，推測這與粗面內質網(wǎng)功能特性有關，粗面內質網(wǎng)的主要功能就是合成細胞外基質等分泌性蛋白。在病理情況下，細胞外基質分泌過多，從而可引起細胞外基質沉積，導致瘢痕形成。

3．4 人CTGF做為一種具有潛在應用意義的細胞因子，發(fā)現(xiàn)于20世紀90年代前期，其作用機理等基礎工作仍需深入。CTGF是一種重要的促纖維化因子，作為TGF/SMADs途徑的下游介質參與病理性瘢痕的形成。通過阻斷CTGF可能減輕TGF-β誘導組織纖維化的效應，同時保留TGF-β有利的抗炎癥和抗腫瘤細胞增生的效應。CTGF的分泌失調可能與病理性瘢痕的發(fā)生和進展有極為密切的關系，調控瘢痕局部CTGF的表達，對延緩瘢痕進展，可能有積極意義。