辣椒素脂質體在兔耳增生性瘢痕組織中的透皮吸收研究

[摘要]目的：探討脂質體包裹的辣椒素對兔耳增生性瘢痕組織的透皮吸收能力。方法：在兔耳增生性瘢痕模型上進行透皮擴散，比較辣椒素脂質體及其普通商用軟膏劑對瘢痕皮膚的滲透能力。結果：在體瘢痕透皮試驗12h后，脂質體組瘢痕組織中的辣椒素單位面積透皮藥量顯著高于軟膏組(40.03±3.2 vs 9.01±2.02μg/cm²，p＜0.01)。結論：在體瘢痕組織透皮試驗中，脂質體劑型均表現出優于軟膏劑型的促進辣椒素透皮的能力。

[關鍵詞]脂質體；辣椒素；增生性瘢痕模型；透皮擴散；

[中圖分類號]R94 R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)07－0881－04

目前在瘢痕的藥物治療研究中發現，多種藥物在體外對瘢痕成纖維細胞均有顯著抑制作用，但臨床上此類藥物的常用外用劑型如軟膏、霜劑等，局部應用卻不能達到較好效果，這與皮膚的特殊結構一角質層以及瘢痕缺乏皮膚附件而阻礙了藥物進入皮膚有關。因此找到一種療效好、全身毒副反應小、又能導入瘢痕皮內并保持較長作用時間的藥物和方法是瘢痕防治的關鍵。

辣椒素(capsaicin，CAP)是一種天然的植物堿，是辣椒中的主要生物活性成分。作為神經肽P物質(substance P，SP)的耗竭劑，新近的研究報道辣椒素具有顯著的抗纖維化作用，可用于瘢痕的防治。

脂質體(liposome，Lip)作為一種透皮給藥新劑型，具有皮膚組織靶向性、緩釋性和無毒性的特點。已有的關于辣椒素脂質體制劑在瘢痕組織離體透皮實驗中，已顯示了其優于常規局部軟膏制劑的促滲透能力的特點。因此，Lip非常有望成為增生性瘢痕局部治療藥物的良好載體。本實驗以兔耳增生性瘢痕模型為對象，對辣椒素的普通軟膏制劑和脂質體制劑的透皮能力進行比較，為尋找一種安全、有效、方便的外用抗瘢痕藥物提供理論依據。

1 儀器與試劑

1．1 材料：新西蘭大白兔；辣椒素標準品(美國SIGMA公司)；辣椒素原料藥(廈門大學)；0.075％(質量比)辣椒素脂質體(自制)；0.075％(質量比)辣椒素軟膏(貴州康運藥業)；甲醇、乙氰(均為色譜純)；其他試劑為分析純。

1．2 儀器：Waters高效液相色譜儀(美國Water公司)，包括Waters 515型泵，Rheonyde7725i進樣器，2487雙波長紫外檢測器，ChromStationTM色譜數據處理工作站；T18勻漿機(德國IKA公司)；DL－360超聲儀(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠)；TGL－16G臺式高速離心機(上海醫用分析儀器廠)。

2 方法

2．1 檢測方法

2．1．1 色譜條件以及標準曲線：色譜柱：C18柱；流動相：乙氰：水=60:40，(V:V)；流速：1.2ml/min；檢測波長：280nm：進樣量：20μl；室溫操作。精取辣椒素5mg，置于5ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得1×10³ mg/L辣椒素儲備液。精密量取該液25、50、100、200、400μl分別置于10ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得到2.5、5、10、20、40 mg/L的標準液。進樣20μl，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標，相應質量濃度為橫坐標進行線形回歸。

2．1．2 回收率與精密度：精密量取線性試驗下的中間三個濃度的標準液，依法各自進樣3次測定并計算回收率和精密度。

2．2 制作瘢痕模型

2．2．1 實驗動物：選用健康成年新西蘭大白兔12只，兔耳健全，雌雄不拘，體重3.0－3.5kg，分籠飼養。

2．2．2 參照Morris氏方法并加以改良建立兔耳增生性瘢痕模型：①用速眠新0.1ml/kg肌注全身麻醉；②嚴格無菌操作技術下，在兔耳腹側面做1cm×1cm大小創面，去掉兔耳全層皮膚及軟骨膜，創緣用烙鐵適當燒灼處理，每只兔耳做4個創面，共96個創面；③術后創面暴露，保持干燥待創面自行愈合，一般需要18－21天。

2．3 在體瘢痕透皮實驗及其檢測

2．3．1 手術后約19天創面完成上皮化時，伴有瘢痕增生，才達到在體透皮擴散實驗的要求。用游標卡尺對創面瘢痕進行測量，以標化用藥面積。

2．3．2 隨機將12只兔的一側耳設定為辣椒素脂質體用藥組，另一側用辣椒素軟膏作對照組。每一側的四個標本中隨機選取三個用藥，余下一個作陰性對照。在每個用藥的瘢痕上分別均勻地涂抹等量兩種制劑，并確保最終辣椒素的用量為100μg，于首次用藥后間隔6h復用等量的藥物一次，共用2次。涂藥范圍嚴格掌握在瘢痕邊緣內1mm處。

2．3．3 末次給藥6h后處死動物，取軟骨以上瘢痕皮膚和鮮血為待檢測標本。

2．3．4 瘢痕標本后處理：①透皮擴散實驗結束后，瘢痕皮膚先用沾有甲醇的試紙搽拭2次后，再用純水沖洗數次，盡量去除皮膚表面殘留的藥物；修剪瘢痕組織，確保最后送檢組織為瘢痕標本表面預標記所對應的實際用藥的瘢痕組織；②然后用相同長度的3M膠帶粘拉表皮面9次，使角質層與活性表皮層和真皮層分離，分別將3M膠帶連同上面粘附的角質層記作標本1(即：角質層部分皮膚)和余下皮膚作為標本2(即：非角質層部分皮膚，簡稱非角質層)；③分別將標本1和標本2剪碎后置于不同的玻璃器皿中，然后加入蒸餾水2ml用高速勻漿機勻漿處理，至皮膚被研磨成漿，再轉移至10ml離心管中，加入甲醇8ml超聲萃取5min，離心(10000r/min，10min)取上清液，用0.5μm孔徑的濾膜過濾后備測；④角質層和其余皮膚中辣椒素含量的測定：將標本1、2和血清液各20μl用HPLC法按“2．1．1”項下條件檢測CAP的含量。

3 結果

3．1 標準曲線、回收率和精密度：標準曲線的回歸方程為：Y=1496.5X+2922.1，r=0.998。CAP濃度在2.5－40.0 mg/L內，峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。；CAP的平均峰面積為：3523.1，RSD為：0.89％，表明本方法具有良好的精密度。

3．2 在體瘢痕透皮實驗：CAP－LIP組和CAP－CRE組瘢痕組織，各自的角質層和非角質層皮膚中，藥物滯留量之間的差異經過SAS8.0軟件作t檢驗分析，P＜0.01，提示兩種制劑的CAP單位面積滯留量的差異有顯著性意義。所有同時抽取之血清和各陰性對照的瘢痕組織各層中均未見有CAP檢出。

4 討論

許多研究證明神經肽對傷口愈合發揮著重要調節作用。SP就是其中重要的神經遞質之一。作為神經遞質、調質、神經源性炎癥介質，免疫調節肽可能參與了傷口愈合的全部生理修復過程，同時在瘢痕不斷增生的病理過程中也起著重要作用。作為神經肽SP的拮抗藥物，CAP在創傷愈合中，可耗竭部分神經肽類物質，減少其局部濃度，瘢痕的另一典型臨床癥狀是瘙癢，在增生的早期癥狀尤為明顯，可能與肥大細胞的脫顆粒釋放組織胺等有明顯的關系。因此，通過運用辣椒素來抑制SP的增加，達到控制瘢痕的發生和瘙癢癥狀，能從多途徑控制傷口愈合過程和瘢痕的發生和發展，從而達到防治瘢痕形成的目的。

關于增生性瘢痕的防治，目前乃整形外科的一大難題。臨床上雖有多種防治方法，如手術切除、壓迫療法、放射治療等，但這些方法不僅時間長、治療需醫生實施、應用不方便，而且效果也不甚理想、瘢痕易復發。目前在藥物治療研究中發現，多種藥物如秋水仙堿、青霉胺、β-丙晴酰胺、γ-干擾素等，在體外對瘢痕成纖維細胞均有抑制作用，但在口服或靜脈應用時對瘢痕的作用較小、全身毒副反應也較大。臨床上激素類藥物有明顯抑制瘢痕的作用，但需注射于瘢痕內效果才明顯，而其常用外用劑型如軟膏、霜劑等，局部應用卻不能達到較好效果，這與皮膚的特殊結構一角質層以及瘢痕真皮增厚、缺乏正常皮膚的附屬結構(毛囊、汗腺、皮脂腺)阻礙了藥物進入，影響了藥效有關。因此找到一種療效好、全身毒副反應小、又能導入瘢痕皮內并保持較長作用時間的藥物和方法是防治作用的關鍵，同時也能方便患者直接用藥。

在藥物透皮新劑型中，Lip的出現是透皮給藥領域的重大進展。Lip系將藥物包封于類脂質雙分子層形成的微型泡囊中，作為藥物載體Lip在應用中具有皮膚組織靶向性、緩釋性、兼溶性、無毒性的特點。因此，Lip與一般促滲劑相比較的一大優勢，就在于Lip促進藥物透過角質層屏障并在局部富積，而不增加藥物的全身吸收，減少了藥物的毒副作用，為透皮給藥系統提供了一個安全、高效、局部無刺激的用藥途徑，解決了如何將藥物導入皮內并局部蓄積而充分發揮其作用的關鍵問題。

體外促滲透實驗研究中，我們已經證實Lip能夠協助包被的CAP透過皮膚表面角質層進入瘢痕組織，并且，獲得局部高濃度；而使用上市的普通軟膏劑型，藥物難以有效地進入瘢痕組織內，說明辣椒素脂質體對人的離體瘢痕組織具有良好的滲透能力并能在瘢痕組織內蓄積。由于體外實驗與在體實驗的差異，體外透皮實驗只能提示藥物所具有的透皮能力，所以不能作為活體實驗的定量指標。因此，本實驗中我們采用兔耳瘢痕模型，對辣椒素脂質體的體內透皮情況作進一步地研究。

創傷后瘢痕愈合是人類特有的一種病理現象，由于在動物身上難以再現這種疾病，使得對其研究受到極大的制約。1997年Morris等以及國內學者李薈元利用兔耳建立了增生性瘢痕模型，并證實兔耳增生性瘢痕與人類增生性瘢痕的發生過程及其結構有著較為相似的病理組織學特征。

在兔耳的瘢痕模型在體透皮實驗中，結果顯示：辣椒素脂質體在真皮中的透皮量極顯著地高于辣椒素軟膏(近4.5倍)，而且在表皮中的貯存量顯著高于辣椒素軟膏組(近1.5倍)。由此說明，與體外的透皮實驗結果相同，在體情況下辣椒素的脂質體劑型同樣具有優于普通軟膏劑的促滲透效果，在瘢痕的活性表皮和真皮組織中，有較高濃度的藥物。對比人的離體瘢痕的體外透皮實驗和兔耳瘢痕模型的在體透皮實驗結果可知，同一劑型的藥物在體的透皮藥量均多于離體實驗的透皮藥量。這種差異可能源于人和兔不同種屬動物之間本質的皮膚滲透性差異、離體和在體的不同環境和理化條件之間造成藥物動力學的差異，對它們的理解將有助于我們在今后的實驗中，選取更為恰當的動物模型完成透皮觀察和藥效學實驗。

在瘢痕性疾病的防治上，強調局部藥物靶向給藥和局部持續的高藥物濃度，那么本實驗辣椒素的脂質體制劑所表現出的良好的促滲透能力，無疑從藥劑學方向上為經皮給藥防治瘢痕性疾病帶來了新的希望。當然，本實驗僅僅是對將脂質體應用到瘢痕透皮給藥的一次初探，不論是在實驗模型用藥的設計和有關檢測方法上有待進一步完善，還是從配方組成和工藝流程，達到改善辣椒素脂質體的包封率、穩定性優化劑型等制劑水平方面入手，都可能會為提高辣椒素脂質體的透皮擴散能力和瘢痕局部用藥模型的建立提供堅實的基礎。