視神經脊髓炎患者血清膠質纖維酸性蛋白的表達及臨床意義

解麗麗 孫一鳴 張美艷 刁劍霞 王蘇平 呂洪濤

[摘要] 目的 通過檢測視神經脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）患者與健康人的血清神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）水平，研究GFAP水平與NMO之間的關系。 方法 收集2013年6月～2015年4月的NMO患者27例和27例健康人的血清，采用酶聯免疫吸附劑法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測樣品吸光度，計算出GFAP的濃度。 結果 NMO患者組的血清GFAP濃度高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。 結論 NMO患者組的血清GFAP濃度高于對照組，血清GFAP濃度與NMO之間有關聯。

[關鍵詞] 視神經脊髓炎；膠質纖維酸性蛋白；酶聯免疫吸附劑法；血清

[中圖分類號] R744.52 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）30-0001-03

Expression and clinical significance of glial fibrillary acidic protein in the seruum of neuromyelitis optic patients

XIE Lili1 SUN Yiming1 ZHANG Meiyan1 DIAO Jianxia1 WANG Suping1 LV Hongtao2

1.Department of Neurology， Dalian Central Hospital， Dalian 116033， China； 2.Department of Neurosurgery， the First Hospital Affiliated to Dalian Medical University， Dalian 116011， China

[Abstract] Objective To study the relationship between GFAP level and NMO by testing GFAP level in serum of neuromyelitis optic patients and health people. Methods Collected the serum of NMO patients （n=27） and health people （n=27） from June 2013 to April 2015. Then detected the absorbance values of the samples by using ELISA experiment， computed the concentration of GFAP. Results The concentration of GFAP in the serum were significantly higher in NMO patients than that in health people， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The concentration of GFAP in the serum are significantly higher in NMO patients than that in health people. The concentration of GFAP is in association with NMO.

[Key words] Neuromyelitis optic； Glial fibrillary acidic protein； ELISA； Serum

視神經脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）是一種主要累及視神經和脊髓中樞神經系統（central nervous system，CNS）的炎性脫髓鞘性疾病，亞洲是發病率最高的地方，患者以20～40歲中青年為主，女性略多于男性，臨床上主要以視神經和脊髓同時或相繼受累為主要特征，大多表現為緩解和復發的病程，發病機制和病因尚未完全清楚[1]。診斷需符合2007年Wingerchuk的NMO診斷標準，治療藥物多以免疫抑制劑為主[1]。星形膠質細胞在NMO免疫過程中具有中樞性作用，而神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是一種星形膠質細胞的生物標志物[2，3]。國外研究顯示[3]在NMO患者的腦脊液中GFAP濃度明顯升高，本研究主要通過檢測視神經脊髓炎（neuromyelitis optic，NMO）患者（2013年6月～2015年4月）與健康人的血清神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）水平，研究GFAP水平與NMO之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院神經內科2013年6月～2015年4月收治的NMO患者27例（男14例，女13例）并收集患者的血清，其中年齡最小25歲，最大55歲，平均年齡（37.5±4.5）歲。另選我院體檢中心的27例健康人作為對照組。其中男13例，女14例。年齡最小22歲，最大56歲，平均年齡（36.5±12.6）歲。NMO患者組與對照組患者在性別構成比、年齡等方面比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 NMO患者診斷標準

（1）年齡15～60歲；（2）均符合2007年Wingerchuk制定的NMO診斷標準[4，5]。必要條件：視神經炎與急性脊髓炎。支持條件：脊髓MRI表現異常，病灶累及超過3個椎體節段；頭顱MRI不符合多發性硬化診斷標準；血清NMO-IgG陽性。如果必要條件全部符合，再加上支持條件中的2條，即可確診為NMO。

1.3 排除標準

（1）曾患有腦卒中；（2）曾患有腦星形細胞瘤；（3）近期感染、組織損傷；（4）其他自身免疫性疾病。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集 空腹采集肘部靜脈血5 mL，存放于EDTA促凝試管中，之后置4℃冰箱2 h，等待血液凝固上下分層后，放到高速離心機中，3000 rpm，離心5 min，吸取上層血清，使用移液器將血清移到2 mL試管中，-20℃冰箱內儲存備用。

1.4.2 主要實驗試劑和儀器 神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）酶聯免疫試劑盒（CUSABIO BIOTECH公司）。常溫離心機（Eppendorf公司，美國），微量移液器（Eppendorf公司，美國），METERTECM ∑960酶標儀（上海醫療器械七廠），BD-132冰箱（海爾公司，青島），37℃細胞培養箱（Shel Lab，美國）。

1.4.3 ELISA檢測步驟 從冰箱取出GFAP抗體ELISA試劑盒，置室溫30 min。準備標準品：在標準品中加入150 μL的稀釋液，調整到20 ng/L濃度，然后倍比稀釋，分別稀釋為5個濃度：1200 ng/L、600 ng/L、300 ng/L、150 ng/L、75 ng/L。將標準品和血清樣品各稀釋5倍，每孔加40 μL的稀釋液，然后加入10 μL樣品，均勻振蕩。用封板膜密封后，37℃孵育30 min。揭開封板膜，去掉液體，甩干，每孔加入洗滌液，放置30 s后棄掉，反復洗滌5次，干燥。每孔（空白孔除外）加入酶標試劑50 μL。再次進行之前步驟。每孔依次加入顯色劑A、B各50 μL，搖勻后避光顯色20 min。每孔加入終止液50 μL，終止反應。設置空白孔為0.450 nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.4.4 結果分析 制作標準曲線y=1352.3x-426.34，根據各個樣品的OD值代入標準曲線方程，測得各個樣品的濃度。

1.5 統計學方法

實驗數據通過SPSS19.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

NMO患者血清GFAP的水平為（655.5±85.8）ng/L，正常人血清中GFAP水平為（249.8±26.3）ng/L；NMO患者組血清GFAP濃度高于健康對照組，差異具有統計學意義（t=2.03，P<0.05），見表1、圖1。

3討論

視神經脊髓炎是主要累及視神經和脊髓的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，且多見于亞洲人。在NMO患者中，炎性機制起到了更為重要的作用，以IgG為主的免疫球蛋白沉淀與堆積在血管周圍，出現嗜酸性細胞的浸潤與補體激活則充分提示為Th2應答。NMO患者中，相對于髓鞘脫失，星形膠質細胞的損傷則更加嚴重。最近的研究發現，中樞神經系統水通道蛋白aquaporin-4（AQP4）抗體（NMO-IgG）是NMO特異性的免疫學標記物[6，7]。

星形膠質細胞在中樞神經系統分布廣泛，對神經元起到支持和營養的作用，在損傷應答、宿主防御和組織修復中發揮重要的作用。星形膠質細胞的活化情況可以由GFAP的表達來反映。GFAP位于細胞核周圍和細胞質中，其相對分子量為5萬，僅僅在星形膠質細胞中表達，而且表達豐富，是星形膠質細胞的重要構成成分，可特異性的標示星形膠質細胞，GFAP的表達量可以反映腦損傷后星形膠質細胞的反應情況。中樞神經系統損傷后，膠質細胞活化增生，胞體肥大、突起增多增長，GFAP快速合成且水平增加，其體液水平是評估星形膠質細胞增多癥和星形膠質細胞激活的重要手段，可以間接反映腦損傷的程度。

GFAP的相關研究表明，在NMO中，隨著星形膠質細胞的破壞，GFAP被釋放入腦脊液導致腦脊液中GFAP水平大幅增加[2，8，9]。Akiyuki U等[10]研究表明腦脊液中的GFAP可能是NMO的診斷標記物。以上研究結果與本實驗結果相一致，NMO患者的血清中GFAP濃度明顯高于對照組，但這種升高是否與視神經病變或脊髓病變相關，仍需要深入進一步的研究。邵林華等[11]研究發現，腦損傷后血清GFAP升高，而且其升高水平與急性期腦損傷的程度可能存在相關性。Dvorak F等[12]研究發現，GFAP表達量的多少可以作為研究腦損傷的膠質細胞反應的標記物。NMO是一種比多發性硬化更嚴重的疾病，NMO致殘與復發的頻率和早期充分的免疫抑制治療策略密切相關[13-15]。

綜上所述，NMO患者中星形膠質細胞的活性增加，引起星形膠質細胞壞死，大大增加了血腦屏障的通透性，從而顯著提高了GFAP在血清中的含量。NMO患者的血清GFAP濃度高于對照組，提示GFAP血清濃度在NMO的臨床診斷上具有一定的應用價值，GFAP能夠早期釋放且穩定，能夠迅速定量測定而且價格便宜，有助于臨床醫生診斷和評估患者病情，為NMO的預防和治療提供了理論依據，可改善患者的預后。

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（收稿日期：2015-06-02）