甜櫻桃矮化砧木ＲＵＳ－２５離體葉片再生植株技術研究

摘要：利用甜櫻桃矮化砧木RUS-25無菌試管苗的葉片作外植體，進行離體葉片再生植株研究。結果表明。培養條件、激素種類和配比均影響不定芽的再生，最適宜的激素配比為MS-F6-BA 2.0mg/L+IBAO.5mg/L+NAA 0.2mg/L，不定芽誘導率為90.3％。

關鍵詞：甜櫻桃；矮化砧木RUS-25:離體葉片；植株再生。

甜櫻桃矮化砧木RUS-25是俄羅斯選育的一個砧木品種，1996年引進。該砧木根系發達、抗寒、抗旱，嫁接甜櫻桃品種后表現為親和力好、樹體矮化明顯、成花結果早，適用于矮化密植栽培和保護地栽培。李文金、蔚承祥等對甜櫻桃矮化砧木RUS-25進行了組織培養及提高生根率的研究，建立了穩定、高效的組培快繁體系。本研究旨在利用離體葉片誘導產生再生植株，為轉基因工程育種奠定基礎。

1 材料與方法

選取生根培養30d(天)的甜櫻桃矮化砧木RUS-25的生根試管苗展開葉片，在超靜工作臺上剪去葉柄、葉緣及葉尖部的1/3，垂直葉脈橫剪2刀，背面向下平鋪接種在MS附加6-BA、IBA等不同激素濃度的誘導分化培養基上(各培養基附加蔗糖30g/L、瓊脂6.0g/L、pH值5.6～5.8，具體見表1)，每個處理接10瓶，每瓶接種2個葉片，重復3次。葉片接種30d(天)后轉接1次，其間調查統計愈傷組織形成情況、芽發生情況；培養60d(天)后調查統計其愈傷組織分化情況、再生芽數。培養環境溫度25土2℃，光照強度2000～3000lx，日光照時間為12h(小時)。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織及芽的生長情況

經過暗培養處理3d(天)后，光照下培養2周，在離體葉片的葉脈剪口處即形成大量的愈傷組織：一種是疏松的淡黃色愈傷組織，一種是白色的愈傷組織；同時在離體葉片上葉脈剪口處形成一種綠色半球形的突起:在光照下培養4周，疏松淡黃色的愈傷組織逐漸褐化死亡，白色愈傷組織上形成小的芽點;而葉脈剪口處形成的半球形綠色突起則能分化出綠色小芽。在16種培養基中(見表1)，RUS-25離體葉片再生芽的優化培養基為8號培養基，平均誘導頻率最高為87.5％。

2.2 暗培養對誘導離體葉片分化影響

表1表明，暗培養對誘導RUS-25離體葉片分化有影響，雖然直接在光照下培養即能形成愈傷組織并能進行芽的分化，但分化率較低。暗處理3d(天)，再生芽頻率達到最大值，暗處理時間延長，再生芽頻率反而降低。

2.3 不同激素對芽誘導的影響

試驗結果表明(表1)，6-BA對誘導RUS-25離體葉片分化有較大影響，濃度過高或過低不利于愈傷組織的脫分化，在6-BA濃度為0.5mg／L的情況下，愈傷組織`的誘導率最高達100％；在6-BA較高濃度下(2.0mg/L)，有利于離體葉片芽的誘導。IBA、NAA對誘導離體葉片分化有較大影響，適宜的濃度為1.Omg/L+0.2mg/L，誘導效果較好，再生芽誘導率達到87.5％。GA3對RUS-25離體葉片分化影響較小，以不添加效果最好。

通過計算比較試驗結果，確定誘導RUS-25離體葉片植株再生的最佳培養基配方為MS4-6-BA 2.Omg/L4-IBA 0.5mg/L+NAA 0．2mg/L。但該組合在本試驗中未出現，后經進一步試驗驗證，該培養基組合誘導分化效果良好，不定芽誘導率達到90．3％。

2.4 不同接種材料對離體葉片愈傷組織誘導率的影響

外植體的葉齡顯著影響甜櫻桃矮化砧木RUS-25離體葉片愈傷組織的誘導(表2)，完全展開的老葉片及未展開的心葉愈傷組織誘導率較低，不定芽再生數量少；新展開的嫩葉愈傷組織誘導率為100％，平均不定芽數為6.1個。

2.5 不定芽的繼代、生根及移栽

由葉片分化得到的不定芽轉接在繼代培養基MS+6-BA 1.0mg/L+ZT O.3mg/L上進行培養，每30d(天)轉接1次，多次繼代試管苗達到一定數量后，轉入MS+IBA0.5mg/L+活性炭0.3％生根培養基，培養3周后，生根率達到93.6％；當試管苗根均長2Cm、有2～3條根時，打開瓶口煉苗7d(天)左右，移栽到滅菌細沙基質中，成活率達90.0％以上。

3 結論與討論

1)櫻桃葉片的離體再生較困難，僅有個別品種能獲得再生植株，但誘導率較低。黃文江等用馬哈利離體葉片，誘導率為31.1％，劉慶忠等用吉塞拉離體葉片，誘導率為70.1％；本試驗通過適宜的激素配比使甜櫻桃矮化砧木RUS-25離體葉片芽誘導率達到90.3％，以此可以推斷，離體葉片的再生能力除受外部條件的影響外，主要由基因型決定。

2)暗培養對離體葉片再生植株影響有差異，有的品種需要進行長時間的暗培養才能誘導出再生植株，本試驗結果表明，暗培養3d(天)即可誘導RUS-25離體葉片再生植株，時間延長，效果反而差。

3)本試驗中6-BA的濃度為2.0mg/L時，甜櫻桃矮化砧木RUS-25離體葉片誘導率最高，為試驗設計的最高濃度，在繼續提高6-BA的濃度的情況下，是否仍能提高離體葉片誘導率有待于進一步的試驗驗證。