組織化學技術在體育科研中的應用

摘要：從普通組織化學、酶組織化學、免疫組織化學、原位雜交組織化學及定量組織化學等方面對國內外組織化學技術在體育科研中的應用研究進行了綜述。隨著現代生物化學和分子生物學的飛速發展，在體育科學研究中普通組織化學方法逐漸退出而被其它更高效、精確的檢測手段如免疫學方法及定量組織化學方法等技術代替。其中，流式細胞技術、激光掃描共聚焦顯微鏡技術和免疫電鏡技術等先進組織化學技術在體育科研中日益顯示出其巨大的應用潛力，并為此方 面的研究提供豐富、穩定、可靠、準確的研究平臺。

關鍵詞：組織化學技術；體育科研；綜述

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-7116(2007)06-0044-04

組織化學是運用組織學、化學、物理學、免疫學、分子生物學等原理與技術，對組織與細胞的化學成分、化學反應及其變化規律進行定性、定位和定量研究的科學。目前組織化學技術已廣泛地應用于體育科學研究當中。本文主要是就目前在體育科研中仍然繼續沿用并不斷發展更新的一些組織化學技術的應用進行闡述，以促進此領域研究的進一步深入。

1 普通組織化學技術

普通組織化學技術是指以常用的組織化學技術，對細胞內主要化學成分和活性的粗略(一般性)的研究。目前在體育科研中，多數用于形態觀察或常規組織學觀察。如對負離心定量運動訓練大鼠的骨骼肌方面組織學變化(肌纖維數目密度變化)及損傷程度研究Ⅲ和探討內服、外用中藥對家兔小腿前群肌肉離心訓練后肌肉形態學、組織學和細胞學的影響等。除對肌肉組織學觀察的研究較多以外，還有一些研究涉及其他器官，如腎臟、性腺等。相關報道有趙汝珠等研究中藥抗疲I號對雌性、雄性訓練Wistar大鼠急進高原并運動力竭后性激素和卵巢、睪丸的防護作用，并對性腺行HE染色進行病理學光鏡觀察等。總之，普通組織化學技術在體育科研中主要用于形態學觀察，一方面從組織與細胞水平分析運動對各臟器的形態學及組織學影響；另一方面，又為相應的生理功能變化發生機理提供佐證或進一步研究的參考。

2 酶組織化學技術

酶組織化學(Enzyme Histochemistry)技術是利用組織細胞內酶具有催化某種反應的特性來檢測酶活性。一般是用凍結或固定的切片，在一定條件下(具有酶的底物等)全酶進行催化作用，產生一種可見產物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對酶的活性進行定位或定量研究。其特點是在原位檢測，且檢測酶的活性而不是酶分子本身。

荷蘭Koopman R等采用酶組化方法測定不同肌纖維中S6KI的磷酸化狀態的變化，發現人體骨骼肌在抗阻訓練后，S6K1的磷酸化增加主要發生在Ⅱ型肌纖維。還有應用酶組織化學方法反映骨骼肌的生理狀態的研究，如黃慶愿等通過酶組織化學方法檢測肌球蛋白ATP酶(myosin-ATPase)從而觀察缺氧及在缺氧條件下運動對大鼠腓腸肌肌纖維形態和毛細血管的影響。此外，酶組織化學方法還應用于運動實踐中物質代謝和能量代謝等方面。如，用以研究未習服熱暴露附加運動負荷(游泳)動物的過氧化脂質(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的變化。

可見，酶組織化學技術在體育科研中主要用于檢測機體生物化學反應過程中具有代表性或限速性的關鍵酶，從而分析機體生理功能狀態，尤其是物質代謝、能量代謝、氧自由基等方面。

3 免疫組織化學技術

免疫組織化學(Immunohistochemistry)技術是組織化學的分支，是用標記的特異性抗體(或抗原)對組織內抗原(或抗體)的分布進行組織和細胞原位檢測技術。此技術在不斷更新檢測手段和克服自身不足中日趨完善，呈現出其他技術無法比擬和替代的優勢。

在神經(腦)研究方面，主要有通過免疫組化sP法觀察不同動情周期、不同訓練強度時雌性大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)和β-內啡呔(β-EP)免疫反應陽性細胞的定量變化的研究，采用免疫組化ABC與SABC法研究下丘腦腹內側核和背內側核、室旁核和視上核、杏仁體核簇、海馬CA₁區中神經型(nNOS)、誘導型(iNOS)、內皮型(eNOS)一氧化氮合酶與不同運動模式或狀態之間的關系。所以免疫組化技術在研究神經遞質/調質，神經內分泌激素，以及其他生物活性物質的定性、定量、定位分析方面起著非常重要的作用。

另外，免疫組化技術在研究心肌與骨骼肌的各種生物活性物質及細胞凋亡方面也有重要的應用。Delchev SD等噪用免疫組織化學方法研究亞強度運動后大鼠心肌細胞線粒體膜酶活性的變化。國內有通過免疫組化ABC法研究不同強度運動訓練對心臟內分泌功能(血漿ANP的含量和心肌組織中ANP的表達)的影響的報道。此外，免疫組織化學技術還應用于觀察運動應激對吸煙大鼠支氣管平滑肌大電導的鈣激活的鉀通道(BK_Ca)和電壓依賴性延遲整流鉀通道Kvl5蛋白表達的影響等方面。

從上述可見，免疫組織化學技術的應用范圍極其廣泛，凡是組織細胞內具有抗原性的物質，如肽類、激素、神經遞質、細胞因子、受體、表面抗原等均可用免疫組織化學方法顯示，并且可以對所研究的大分子物質進行定位、定性與定量分析，進而深入研究其功能，綜合分析其作用機理。因此目前在體育運動領域的基礎理論與實踐應用科研中都被廣泛運用。

4 原位雜交組織化學技術

原位雜交組織化學(In Situ Hybridization Histo-chemistry)技術是基于利用標記物f熒光素、酶、重金屬離子等)或放射性核素(已少用)作為示蹤劑，通過核酸雜交(堿基配對特異性連接)途徑，在組織切片或細胞涂片上，原位顯示生物大分子物質基因表達的動態變化而建立的一門組織化學技術。基本特點是“特異、靈敏、準確、原位”，是分子生物學研究的常用手段。如Holmes PV等采用原位雜交組織化學技術對不定量隨意運動和抗抑郁藥物一海地芬治療提高促生長激素神經肽中mRNA水平影響的研究。Timofeeva E等采用原位雜交組織化學技術研究跑臺運動對大腦興奮性與促腎上腺皮質素釋放激素系統的影響。而國內有通過原位雜交的方法結合圖像分析，觀察運動訓練中不同負荷和運動后不同恢復時相的大鼠腦組織一氧化氮合酶(NOS)和ET-1 mRNA的表達的研究報道另外，采用原位雜交組織化學技術研究低氧訓練對大鼠骨骼肌血管內皮生長因子(VEGF)基因表達的影響等。至此，原位雜交組織化學技術突破了組織化學分子水平研究的瓶頸，為原位研究各種運動狀態下相關基因的變化提供了有力的手段。

5 定量組織化學技術

隨著現代物理學的飛速發展，新理論新技術不斷出現，發明了一批新的儀器，從而使組織、細胞的化學成分提高到定量分析的水平。最常用的有顯微分光光度計、流式細胞儀、激光掃描共聚焦顯微鏡等。

1)流式細胞儀。流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是20世紀70年代發展起來的先進科學技術，具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀，還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等；可對群體細胞在單細胞水平上進行分析，在短時間內檢測分析大量細胞，并收集、儲存和處理數據，進行多參數定量分析；也能夠分類收集(分選)某一亞群細胞，分選純度＞95％。FCM以其快速、靈活、大量、靈敏和定量的特色，廣泛應用于基礎研究和應用實踐，在體育科研中發揮著重要的作用。近年來，在免疫方面的研究有運用流式細胞技術探討免疫參數與測試對象的身體素質、技術水平和機能狀態關系的研究報道，還有應用流式細胞儀檢測紅細胞CD35來探討HiHiLo對機體紅細胞CD數量及活性的影響研究。

此外，流式細胞術還廣泛應用于研究心肌和骨骼肌細胞凋亡并取得喜人的成果，同樣Lagranha CJ等結合使用流式細胞術與熒光顯微技術探討補充谷胺酰胺對運動引起大鼠中性粒細胞凋亡的影響進行分析。Ding YH等使用流式細胞儀做運動預處理提高心臟局部缺血大鼠大腦整合機能的研究。

2)激光掃描共聚焦顯微鏡。激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)是20世紀80年代發展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產品。與免疫熒光組化結合，實現了對細胞內部非侵入式光學斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留在表面單層、靜態平面的觀察進行到立體、斷層掃描、動態全面的觀察，在生命科學研究中得到迅速應用。其性能特點是分辨率高、靈敏度高、掃描速度快、掃描范圍大、圖像存取方便，可進行“光學切片”的觀察，可進行定量熒光分析。Higa-Taniguchi KT等采用共聚焦顯微鏡對運動訓練導致正常大鼠與高血壓大鼠室旁核內腎上腺素能分布變化的影響進行研究。常蕓等應用激光掃描共聚焦顯微鏡與新一代鈣熒光指示劑Fluo-3AM負載方法觀察心肌活細胞內具有生物活性的游離鈣的動態變化，從而探討運動心臟結構與功能的發生、轉歸及其與病理心臟的本質差異。

組織化學技術是一門龐大復雜、綜合全面的分析技術，具有很強的外延擴展性，隨著組織學、化學、物理學、免疫學、分子生物學等基礎學科的不斷發展，也會不斷地擴展其研究手段和方法。而這些方法手段在體育科研中有廣闊的應用前景，它將為此方面的研究提供豐富、穩定、可靠、準確的研究技術。如流式細胞技術的廣泛應用，能在單細胞水平上，大量地、多參數地定量分析與運動機能相關的指標，為運動訓練和健身運動的科學合理安排提供重要的參考依據。而激光掃描共聚焦顯微鏡技術能使研究更深入到立體、斷層、動態的分析水平。另外，目前在運動醫學領域還沒有得到廣泛應用的免疫電鏡技術，能夠更好地從亞細胞水平研究分析運動生理功能。以上幾項各有優勢的實驗技術將在體育科學研究領域具有非常良好的應用前景，也將是研究的熱點。相信先進的組織化學技術在體育科研中的充分應用，必將促進此領域分子水平研究的快速提高。

[編輯：鄭植友]