疏血通注射液對急性腦缺血抗凋亡作用實驗研究

【摘要】 目的 探討疏血通注射液對鼠腦缺血損傷的保護作用。方法 采用自體血栓注入、閉塞大腦中動脈的方法制備MCAO模型，對照觀察假手術組、MCAO模型組、疏血通治療組腦梗死范圍、腦含水量、神經功能評分、腦組織病理變化、腦缺血邊緣區神經元凋亡和凋亡相關基因bcl2、bax蛋白表達的變化。結果 疏血通治療組與其他兩個對照組相比，能顯著改善神經功能缺失癥狀，減小梗死體積和腦水腫含量、腦組織顯微結構及超微結構改變均較輕，缺血邊緣區神經細胞凋亡細胞數量減少，bcl2表達增多，bax表達明顯減少(P均<0.05或<0.01)。結論 疏血通注射液對缺血性腦損傷有顯著的神經保護作用。

【關鍵詞】 疏血通注射液；腦缺血；保護作用；鼠

文章編號：1003-1383(2007)03-0242-03

中圖分類號：R 364.1 文獻標識碼：A

疏血通注射液是動物類中藥復方制劑，由水蛭、地龍合理組方經低溫提取、膜分離等先進工藝精制而成，主要用于心、腦缺血性疾病的防治。本文通過動物實驗，探討疏血通注射液對急性腦缺血的抗凋亡作用機制，為臨床治療提供理論依據。材料與方法

1.實驗材料

(1)動物：SD大鼠，體重230－300 g，雌雄不拘，由濟寧醫學院實驗動物中心提供。

(2)藥物和試劑：疏血通注射液由牡丹江友博制藥有限公司提供(國藥準字Z0010100號)；紅四氮唑（TTC）由上海生物工程公司提供；凋亡試劑盒購自美國ROSS公司；兔抗Bcl2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、SP9001均購自美國Santa cruz公司，由北京中山生物技術公司分裝。

(3)儀器：TD2000圖像分析系統（北京天地公司）；24號靜脈留置針（型號REF 383213，規格0.7×19 mm），4號硬脊膜外麻醉導管(型號F3×70，0.7－1.0×700)，分析天平（日本島津）。

2.方法

(1)分組：實驗動物按隨機數字表法隨機分假手術組、局灶腦缺血對照組、局灶腦缺血疏血通治療組，每組30只大鼠。

(2)局灶腦缺血模型制作：采用自體血栓大腦中動脈閉塞模型：用3.5%水合氯醛1 ml/kg腹腔麻醉大鼠后，取左側頸部直切口， 分離左頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，電凝頸外動脈分支：甲狀腺上動脈，枕動脈，結扎頸內動脈重要分支翼腭動脈。離斷頸外動脈（假手術組到此步為止）， 從頸外動脈插入24號靜脈留置針，將針芯拔出，取血0.5－1.0 ml，4000 r/min離心２分鐘，按５∶1吸取血漿及少量紅細胞10 μl，加入凝血酶3－4 μ，制成直徑 為0.35 mm的血栓，切成1.5 mm大小，用麻醉導管吸取6－8個血栓，接到靜脈留置針末端，快速將栓子推入頸內動脈(ICA)內。動物蘇醒后按Bederson 評分標準立即進行神經功能缺失評分，有體征者入選。

(3)給藥方法：治療組按0.25 ml/kg疏血通注射液濃縮液，局灶腦缺血對照組予以等量生理鹽水，均于造模后6小時內經尾靜脈注入，以后每天一次連續5天。

(4)神經功能缺損評分：進行兩次神經功能缺損評分，于造模成功后第一天進行神經功能缺損評分，治療、觀察5天后再進行一次。按Bederson 評分標準［1］評分，0級（0分）：無神經功能障礙；1級(1分)：提大鼠尾，見癱瘓側前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2級(2分)：除1級體征外，向癱瘓側推時感阻力較對側明顯降低；3級（3分）：除以上體征外，大鼠爬行時向癱瘓側旋轉。

(5)腦梗死體積測定：每組取10只大鼠于造模5天神經功能缺損評分后取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩下的部分立即冠狀切成5片，置于2%的TTC溶液中染色，梗死區為蒼白色，正常為玫瑰紫紅色［2］。用TD2000圖像分析系統測出各層的梗死面積，總面積之和乘以層厚即為體積（mm3）［3］。

(6)腦含水量的測定：每組取10只大鼠用干濕重法測腦組織含水率，實驗終點，將大鼠斷頭取腦立即切成左右兩半，迅速用電子天平稱取病灶側半球的重量，然后置于100℃烤箱內烤24小時，用同一天平再次稱重，以［(濕重－干重)/濕重×100%］即為相對含水量［4］。

(7)組織病理學觀察：每組取7只大鼠，用４％的多聚甲醛灌流固定，切為５μm的石蠟切片，每個腦標本隨機選其中兩張進行常規HE染色觀察病灶區組織病理顯微結構變化，其余的用于細胞凋亡原位末端（TUNEL）標記、Bcl2及Bax蛋白兔疫組化染色觀察神經細胞凋亡及相關基因的表達。另外每組取3只大鼠用２.5％的戊二醛灌注固定后，取病灶周圍腦組織修成1 mm3的組織塊送電鏡觀察超微結構改變。

(8)凋亡細胞和Bcl2、Bax蛋白表達檢測：凋亡細胞檢測用末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法即TUNEL法，參照試劑盒說明進行。Bcl2、Bax蛋白表達按常規ABC法染片，DAB顯色，蘇木素復染，封片。在40倍物鏡下觀察每張切片TUNEL陽性細胞、Bcl2、Bax免疫陽性細胞的表達情況，用計算機圖像分析系統TD2000處理，采集圖像輸入計算機，以灰度計算所選視野陽性染色的單位面積(陽性細胞的面積占所選整個視野面積的百分比)，每張切片取梗死灶邊緣區互不重疊的5個視野，其均值即為該標本每個高倍鏡視野中陽性細胞的單位面積。

3.統計學處理 所得結果均以均數±標準差（-±s）表示，應用ssps10.0 forwindows統計學軟件進行統計處理。

結果

1.疏血通對大鼠神經行為、腦梗死體積和腦含水量的影響結果 第1天局灶腦缺血組和疏血通治療組（用藥前）神經功能缺失評分并無顯著性差異。第5天經過疏血通的治療，疏血通治療組神經功能缺損評分明顯降低，和局灶腦缺血組比較差異顯著(P<0.01)；且疏血通治療組梗死范圍以及腦組織含水量亦明顯低于局灶腦缺血組，有較顯著的差異(P<0.01)。表明疏血通對腦組織缺血有明顯治療作用。見表1。

2.組織病理學變化 光鏡下假手術組大鼠皮層各層細胞排列整齊，神經元結構完整，神經基質無水腫，基底神經節區神經元結構正常，神經纖維無損壞，局灶腦缺血組大鼠病理改變為神經元結構模糊，胞體腫脹，胞核淡染，核固縮，尼氏小體減少或消失等變化；疏血通治療組見大腦皮質錐體細胞和腦實質神經細胞結構清楚，核固縮、核溶解程度較局灶

作者簡介：吳蘇寧(1965-)，男，山東省濟寧市人，副主任醫師，醫學碩士。腦缺血對照組明顯減輕，病變范圍明顯縮小。電鏡下假手術組大鼠細胞膜完整，核仁清楚，細胞器結構形態正常。局灶腦缺模型組神經細胞變性、壞死，部分溶解。線粒體腫脹、變形。核染色質邊集，細胞器結構紊亂。疏血通治療組神經元胞體輕度腫脹，核膜完整，核染色質分布均勻，神經氈輕度腫脹，部分血管管周輕度水腫，較局灶腦缺模型對照組超微結構改變明顯減輕。

3.凋亡細胞和Bcl2、Bax蛋白表達檢測結果 光鏡下TUNEL染色陽性的凋亡細胞為圓形或橢圓形，細胞核或胞漿中有棕色顆粒，核染色質濃聚呈邊聚觀象，似月牙形，有時可見細胞膜皺褶，以及芽生形成膜包裹的凋亡小體。陽性細胞呈簇狀或散在分布于梗死灶邊緣區域。假手術組腦組織TUNEL染色只有零星的細胞凋亡，而局灶腦缺血對照組凋亡細胞略有增多，疏血通治療組較缺血對照組凋亡細胞明顯減少(P<0.01)。光鏡下 Bcl2陽性細胞核膜和胞漿呈棕黃色。假手術組可見少量表達，局灶腦缺血對照組較假手術組增多(P<0.01)，多分布在缺血周圍區域，而病灶中心未見陽性細胞。疏血通治療組表達最多，與局灶腦缺血對照組及假手術組比較有顯著性差異(P<0.01)。光鏡下Bax陽性細胞胞漿、胞核均著色，呈均勻彌漫棕黃色染色，多分布于缺血周圍區域， 疏血通治療組Bax陽性細胞的表達明顯少于局灶腦缺血對照組(P<0.01)。見表2。

討論

急性缺血性腦血管病是一種常見病、多發病，死亡率及致殘率均很高。迄今為止，尚無普遍有效的治療措施。已有研究表明，腦血管閉塞后若缺血區血流未能在短期內恢復供應，處于嚴重缺血狀態的中心區會很快發生壞死即梗死，而梗死灶周圍的缺血邊緣區則出現神經細胞的凋亡，邊緣區中細胞凋亡的發生可能是梗死灶擴大的關鍵［4］。如不能及時糾正或提早預防半暗區神經元凋亡的發生，半暗區將不可避免成為永久性梗死灶的一部分。而阻斷缺血半暗區神經元凋亡，對于減少梗死灶體積，改善中風患者的預后具有重要意義

本實驗結果表明：疏血通注射液能顯著減少缺血邊緣區神經細胞凋亡數量、促進抗凋亡的Bcl2蛋白的表達，抑制促凋亡蛋白Bax的表達，從而有效地抑制了神經元的凋亡和進一步的壞死，對缺血腦組織具有顯著的保護作用，同時結果也表明疏血通注射液組大鼠腦梗死范圍、腦水舯、神經功能缺損均明顯低于對照組。

疏血通注射液主要成分是水蛭、地龍，其主要有效成分為水蛭中的水蛭素類和地龍中的蚓激酶樣作用物質，其抗腦缺血的主要作用機制為一方面可通過其促纖溶、抗凝作用，溶解血栓使血管再通而恢復血液灌注，及時改善缺血半暗區血液循環，阻止病變進一步惡化、進展。另一方面可通過其神經保護作用如抑制神經細胞的凋亡及壞死等作用機制，減輕缺血半暗區腦組織損傷。本研究結果闡明疏血通注射液具有減輕腦組織水腫，抑制神經細胞的凋亡及壞死等腦缺血保護作用，為臨床腦血管病的防治提供理論依據。

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